作者：张兴儒,李青松,项敏泓,蔡瑞霞,俞彰
作者单位：1（200062）中国上海市，上海中医药大学附属普陀医院眼科;2（200032）中国上海市，复旦大学上海医学院电镜室
【摘要】目的：评价结膜松弛症泪液功能及结膜杯状细胞的组织病理学及超微结构改变。方法：结膜松弛症与正常对照组各30例（60眼）进行泪膜破裂时间（tear breakup time,BUT）Schirmer Ⅰ试验、泪液羊齿状试验（tear ferning test,TFT）检查。对10例松弛球结膜组织和10例对照组球结膜对应区组织，采用PAS,AB和HE 染色，对照观察组织病理及超微结构改变。结果：结膜松弛症组BUT（7.72±2.90s）较对照组（14.40±3.68s）减少明显（P＜0.05）。基础Schirmer试验中结膜松弛症组（13.20±4.07mm）较对照组（16.73±4.41mm）明显降低（P＜0.05）。结膜松弛症组泪液中羊齿状结晶明显减少，与对照组间比较差异有显著意义（P＜0.05）。结膜松弛症球结膜上皮中的杯状细胞密度为2.75±2.68/100个上皮细胞，对照组为4.64±3.25/100个上皮细胞，两组间差异无显著性（t=1.42，P=0.172）。随着结膜松弛症程度加重，球结膜杯状细胞密度降低。结膜松弛症球结膜杯状细胞组织形态和超微结构有异常。结论：结膜松弛症泪膜稳定性下降、泪液分泌减少，泪液中黏蛋白减少，结膜杯状细胞数量减少，超微结构有异常。
【关键词】 结膜松弛症 Schirmer Ⅰ试验 泪膜破裂时间 泪液羊齿状试验 结膜杯状细胞 组织病理
0引言
结膜松弛症(conjunctivochalasis)是老年性常见眼病[1]，是由于球结膜过度松弛和/或下睑缘张力高，造成松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学异常，并伴有眼部干涩、异物感、溢泪不适等症状的疾病[2,3]。有研究发现结膜松弛症可引起泪液动力学异常型干眼[4，5]，泪液功能的改变在结膜松弛症的发生与发展中可能起一定的作用。泪膜的稳定性是由脂质层、水液层、黏蛋白层以及泪液动力学等共同维持。结膜杯状细胞主要功能是分泌黏蛋白，黏蛋白是泪膜的重要成分，对稳定泪膜、保护眼表、参与信号转导、维持眼表功能等方面起着重要作用。当各种内、外源性因素引起杯状细胞数量或分泌功能改变时，黏蛋白数量和质量将发生异常。泪液羊齿状试验（tear ferning test，TFT）间接反映了泪液黏蛋白的功能。200710/200810通过对结膜松弛症患者进行泪液功能改变检测和球结膜杯状细胞组织病理学及超微结构观察，探讨结膜松弛症的发病机制。
1对象和方法
1.1结膜松弛症的病例选择标准[6]
选择标准：(1)患者有流泪、干涩、异物感等相关症状之一。(2)裂隙灯显微镜检查球结膜过度松弛成皱褶堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间，阻碍泪液流向。(3)泪河异常、残缺不完整。(4)观察角膜、泪腺及泪小点正常，无泪小点狭小、闭塞或缺如，冲洗泪道通畅，无引起鼻泪管开口处阻塞的鼻腔病变或异常者，睑缘无内、外翻及倒睫。(5)无影响泪液学异常的其他眼病及全身性疾病，也无眼部手术史，3mo内未应用影响泪液的药物。
1.2对照组的病例选择标准[5]
选择标准：(1)患者无眼部不适主诉。(2)裂隙灯显微镜检查眼表形态结构无异常。(3)3mo内未应用影响泪液的药物。(4)随机年龄配对单纯白内障手术患者。
1.3分组
结膜松弛症组：30例（60眼），男12例，女18例，年龄46～79(平均70)岁。按诊断分级标准[7,8]：Ⅰ级15眼，Ⅱ级20眼，Ⅲ级20眼，Ⅳ级5眼。对照组30例（60眼），男女各15例，年龄45～80(平均71)岁。
1.4实验材料及仪器
裂隙灯显微镜（苏州医疗器械厂）。自吸式毛细玻璃管（中国医药集团上海化学试剂有限公司）。显微镜载玻片（上海机械进出口公司）。泪液检测滤纸条和荧光素钠眼科检测试纸（天津晶明新技术开发有限公司）。Olympus BX51双目光学显微镜。HMIAS2000高清晰度彩色医学图文分析系统（武汉千屏影像技术有限责任公司）。
1.5实验方法及检测指标
对所有结膜松弛症和对照组患者进行泪液功能评估，采用泪膜破裂时间（tear breakup time，BUT）评估结膜松弛症患者泪膜的稳定性，采用SchirmerⅠ试验评估结膜松弛症患者泪液分泌量的变化，采用泪液羊齿状试验（又称蕨类试验）评估泪液中黏蛋白质含量的变化。所有检查均由同一人完成。
1.5.1泪膜破裂时间测定
用1滴生理盐水浸润荧光素钠滤纸条，将蘸湿部分轻轻接触受试者的结膜。嘱患者瞬目数次，使荧光素在角膜表面均匀分布。然后让患者自然开大眼睑，同时秒表计时，记录从最后一次瞬目到角膜表面出现第一个黑斑的时间。重复3次，取其平均值计算。
1.5.2 SchirmerⅠ试验
在同一暗室内进行。检查时间均为每天10∶00～12∶00am，检查前结膜囊内滴入5g/L盐酸丙美卡因滴眼液1滴5min后，将试纸圆头端沿折线处折叠置于患者下睑结膜囊中外1/3处，5min后取出试纸，测量湿长。重复2次，取其平均值计算。
1.5.3泪液羊齿状试验
检查时间均为每天10∶00～12∶00am，通过10μL的玻璃毛细管在下睑结膜囊泪阜处通过虹吸方法吸取泪液标本（未使用表面麻醉药物或其他化学性药物），尽量不接触眼表。将泪液标本吹入载玻片，在25℃室温下（空调控制温度与湿度）干燥10～20min，置于双目光学显微镜下观察（放大倍数为100×）评级。按照Rolando等[9]的图形分级方法：按泪液羊齿状结晶的完整性、均匀性和分支状态分为4级。Ⅰ级：载玻片上出现均匀、致密的羊齿状分支结晶图，分支间的空间间隔很小。Ⅱ级：出现的羊齿状结晶图的分支数量较少、形态较小，分支间的空间间隔增大。Ⅲ级：结晶图分支明显减少，分支间的空间间隔显著增大，增大的间隔足以形成新的结晶。Ⅳ级：几乎观察不到羊齿状的结晶图，只能看见少量、不定型的结晶。Ⅰ级和Ⅱ级均为正常，Ⅲ级和Ⅳ级为异常。
1.6标本收集、处理及制作方法
200710/200803在本院结膜松弛症手术治疗的病例中采集10例结膜松弛症病例，男4例，女6例，66～79(平均72.8)岁。按分级标准[79]：Ⅰ级2例，Ⅱ级3例，Ⅲ级4例，Ⅳ级1例。对照组为随机年龄配对在本医院单纯白内障手术患者10例，男4例，女6例，年龄65～80(平均72.2)岁。结膜松弛症患者年龄与对照组年龄差异无显著性（t=0.32，P=0.75）。所有病例球结膜标本均根据告知自愿的原则。手术切除的松弛结膜和对照组切除的对应区域球结膜均采用双眼鼻下方区域：右眼4∶30～5∶30方位；左眼6∶30～7∶30方位，距角膜缘后4mm，标本采集面积2mm×4mm，同一专人操作，标本采集做到同部位、同面积、同方法。病变组和对照组标本完全随机统一编号，每一个标本对于病理医师和电镜师采用盲法观察球结膜杯状细胞的形态数量和超微结构。
1.7手术方法
按结膜松弛症新月形手术切除方案进行[10，11]，先用5g/L爱尔卡因结膜囊内滴眼3次，每次间隔3min。表面麻醉完成后，开睑器开睑，嘱患者平视，将松弛结膜皱褶向下穹窿部方向推下，使其松弛结膜皱褶位置距角膜缘超过4mm。根据松弛结膜程度用眼显微无齿镊夹提松弛结膜估算手术切除范围，一般宽约3～6mm,使其球结膜平整，切除松弛结膜后用100尼龙线连续缝合结膜。用3×106U/L庆大霉素稀释液冲洗结膜囊，涂3mg/g泰利必妥眼膏包眼。术后1d术眼开始用4.2×106U/L贝复舒滴眼液和3g/L氧氟沙星滴眼液1wk;7d后拆线。
1.8组织病理学标本
采集的标本立即用40g/L甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，5μm切片，用PAS（peviodic acid Schiff）染色和AB(Alcian blue)染色显示杯状细胞。电镜标本：采集的标本用25g/L戊二醛（0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH 7.2）保存固定后，样本切成<1mm的3小块，10g/L PSO4（0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH 7.2）后固定2h。梯度乙醇脱水，618环氧树脂包埋。超薄切片经铀—铅染色后在JEM—1200EX透射电镜下观察。
统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件包对数据进行统计学分析。数据用均值±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，结膜松弛症组和对照组泪液羊齿状试验比较，采用率或构成比差异的卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 BUT测定
结膜松弛症组的BUT值7.72±2.90s，与对照组BUT值(14.40±3.68s)比较，差异有统计学意义（t=11.05，P＜0.01）。
2.2 SchirmerⅠ试验测定
SchirmerⅠ试验中结膜松弛症组（13.20±4.07mm）与对照组（16.73±4.41mm）比较，差异有统计学意义（t=4.56，P＜0.01）。说明结膜松弛症存在泪液分泌量的减少。
2.3 TFT测定
结膜松弛症组60眼的泪液中羊齿状结晶：Ⅰ级9眼(15%)，Ⅱ级14眼(38%)，Ⅲ级34眼(57%)，Ⅳ级3眼(5%)。而对照组60眼的泪液中羊齿状结晶：Ⅰ级24眼(40%)，Ⅱ级33眼(55%)，Ⅲ级3眼，仅占到5%（3/60），未发现Ⅳ级表现。结膜松弛症组与对照组比较，结膜松弛症组患眼泪液中羊齿状结晶明显减少，差异有统计学意义（DF=3，P=0.001，表1）。随着结膜松弛症病程的加重，泪液中羊齿状结晶明显减少，差异有显著意义（DF=9，P=0.001）（表1，图14）。结膜松弛症Ⅰ级15眼中14眼（93%）为正常（Ⅰ级和Ⅱ级），1眼(7%)为异常（Ⅲ级）。结膜松弛症Ⅱ级20眼中7眼(35%)为正常（Ⅰ级和Ⅱ级），13眼(65%)为异常（Ⅲ级）。结膜松弛症Ⅲ级20眼中2眼(10%)为正常（Ⅱ级），18眼(90%)为异常（Ⅲ级和Ⅳ级）。结膜松弛症Ⅳ级5眼均为异常，其中Ⅲ级3眼（60%），Ⅳ级2眼（40%）。表1TFT的分级比例比较n(略)
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