作者：张俊霞，张德秀，刘思伟，刁鹏飞，陈丽
作者单位：(710061)中国陕西省西安市,西安交通大学医学院第一附属医院眼科
【摘要】 目的：建立牛眼小梁细胞体外培养体系，观察高浓度葡萄糖对小梁细胞的影响，研究高糖与开角型青光眼（primary open angle glaucoma,POAG）以及糖尿病与POAG之间的关系，探讨糖尿病开角型青光眼的发病机制，从而为指导开角型青光眼的临床用药提供重要依据。方法：以新鲜牛眼为材料，分离并培养小梁细胞，用光学镜、电镜观察正常小梁细胞的形态。将传至第3代的小梁细胞制作成细胞悬液、计数并接种于培养板（或培养瓶）中，待细胞贴壁后，将细胞分为两组：对照组（葡萄糖浓度为5.5mmol/L）和高糖组（葡萄糖浓度为35mmol/L），分别培养7d后收集细胞，用透射电子显微镜、MTT法、流式细胞仪(FCM)检测法，研究高糖对小梁细胞形态、增殖和凋亡的影响。结果：高糖组与对照组相比较，小梁细胞胞浆内细胞器减少，内质网、高尔基复合体、线粒体等细胞器肿胀，溶酶体及脂肪滴增多，核浆比减小，可见凋亡小体；高浓度葡萄糖对小梁细胞的增殖有明显的抑制作用，能够促进小梁细胞的凋亡，均有统计学意义（P<0.05）。结论：高糖可能通过使小梁细胞的增殖能力下降，凋亡率增加，使近管小梁网的网状结构改变，网孔变小，改变房水流出途径的阻力导致眼内压升高，可能是糖尿病患者POAG发病率增高的原因之一。
【关键词】 牛眼小梁细胞 高糖 细胞培养 开角型青光眼 增殖 凋亡
0引言
原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma,POAG）是一种较常见的致盲性眼病，糖尿病是其危险因素之一。Rozsa等[1]研究发现糖尿病患者中糖含量较正常人的明显增高（正常约为3.2mmol/L，糖尿病患者约为7.8mmol/L）。Sato等[2]动物实验证实糖尿病小鼠房水中糖含量为无糖尿病小鼠的2～3倍。在糖尿病患者中POAG的发病率为4%～11%，约为非糖尿病人患者青光眼的3倍[3]，在POAG患者中6%～13%有糖尿病[4]，因此，糖尿病与POAG间的关系较为密切。然而糖尿病患者并发POAG的发病机制尚不明确。有研究发现，高糖条件下，小梁细胞外基质成分明显增多，导致房水流出阻力增加[57]。但尚没有高糖对小梁细胞影响的研究，我们主要研究高糖条件下，小梁细胞在形态及增殖等方面的变化，从而进一步探讨糖尿病与POAG之间的关系。
1材料和方法
1.1样本来源与分离小梁网 于屠宰场取现杀健康新鲜小牛眼，牛龄<24mo，取材后用4℃冰桶在1h内运回实验室。剪除眼球附属组织，进行清洗及消毒后。于超净台的无菌培养皿中分离小梁网，将分离浸洗后的小梁组织剪成0.5mm2大小碎块，分别移入100mL培养瓶，组织块以3～5mm间距为佳。
1.2小梁细胞培养 运用改良方法[810]，待小梁细胞游离出组织块后，每3d换液1次。至细胞长至融合期并铺满瓶底时，加入适量1.25g/L的胰蛋白酶和0.2g/L的EDTA消化传代，以1∶2比例传代。选择3～5代细胞进行实验研究。
1.3光镜标本制备 将传3代细胞接种在盖玻片上，培养1～2wk后取出，用0.01mmol/L PBS清洗3次，空气晾干，分别进行瑞士姬姆萨（WrightGiemsa）、考马斯亮蓝（coomassie BB）R250，异硫氰酸萤光素鬼笔环肽（Fluorescien Isothioeyante FiTCphalloidin）染色，封片干燥后用系统生物显微镜（Olympus）观察、拍照。
1.4电镜标本制备 将传3代细胞的接种在4个25mL培养瓶中，待细胞达汇合后，用0.01mmol/L PBS清洗3次，随机分为两组，分别加入含不同葡萄糖浓度(5.5，35mmol/L) 的DMEM培养液，培养7d后，用0.01mmol/L PBS清洗2次，1200转离心2min，将离心后的细胞取出后切成1mm3的小块，立即置于20g/L戊二醛固定液中4℃固定2h以上，0.1mmol/L磷酸缓冲液浸洗10min，乙醇梯度脱水，还氧丙烷置换10min；环氧树脂Epon 812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1～2μm,美蓝染色后光学显微镜下定位，超薄切片机（瑞典，LKB）进行超薄切片50～70nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，在透射式电子显微镜(日本，H600)下观察、拍照。
1.5 MTT标本制备 传3代细胞接种于96孔培养板，1×105细胞/孔，每孔培养基总量200μL（以后每次换液均保持该培养基总量不变），EM在恒温培养箱中培养2wk细胞达汇合，用0.01mmol/L PBS清洗3次，随机分为两组，分别加入葡萄糖浓度为5.5mmol/L和35mmol/L的DMEM培养液，并以葡萄糖浓度为5.5mmol/L的DMEM溶液作为空白调零组，16孔/组，培养7d，加入MTT试剂（美国Sigma 公司），20μL/孔，加入二甲基亚砜DMSO（美国，GAYLORD）液，150μL/孔，继续培养4h，振荡5min后，以空白组调零，用全自动酶标仪（美国，Bio TEK）检测A值（检测波长490nm）。根据A值计算抑制率，抑制率=(对照组A值实验组A值)/(对照组A值)×100%。
表1 高糖对牛眼小梁细胞增殖（光密度值）的影响（略）
bP<0.01 vs对照组
1.6流式细胞术标本制备 将传3代细胞以1×104/mL密度接种于24孔培养板，在恒温培养箱中培养2wk细胞达汇合，用0.01mmol/L PBS清洗3次，随机分为两组，分别加入葡萄糖浓度为5.5mmol/L和35mmol/L的DMEM培养液，培养7d后，消化上述孔中的细胞并悬浮于16只小管中，调整各管中细胞数为1×106个。各管中细胞经洗涤并离心2次后悬浮，先后加入AnnexinV (Fitc标记) 5μL和碘化丙啶(propidine iodide，PI) 5μL避光反应15min，再加入Binding Buffer混匀，在30min内用流式细胞仪(美国，BD)测试。
统计学分析：所有数据均用SPSS 13.0软件建立数据库，数据以(±s)表示，采用t检验进行统计学分析，检验标准P<0.05时有统计学意义。
[1] [2] 下一页 |
