作者：董晓飞，柳林
作者单位：（200433）中国上海市，第二军医大学附属长海医院眼科
【摘要】目的：研究并验证成年哺乳动物视网膜中Müller细胞经刺激后可以产生神经干细胞特性。方法：对6周龄VC大鼠右眼玻璃体腔内注射神经毒素混合液（含NMDA，kainate，FGF2和insulin）刺激Müller细胞，左眼玻璃体内注射PBS作为对照眼。1wk后取眼并分离Müller细胞体外原代纯化培养7d。流式细胞技术鉴定Müller细胞纯度，通过细胞免疫荧光组织化学和流式细胞技术鉴定神经干细胞标志物nestin在Müller细胞上的表达。结果：流式细胞分析结果显示，本实验分离培养的原代Müller细胞纯度可达96%以上；细胞免疫荧光组织化学显示激活后Müller细胞能表达nestin，流式细胞技术证明，激活后培养的细胞中表达nestin的细胞可达总细胞量的53.5%。结论：成年大鼠视网膜Müller细胞经神经毒素在体刺激后可以产生神经干细胞特性。
【关键词】 干细胞 Müller细胞 哺乳动物
0引言
近年研究证实，低等脊椎动物的眼中存在神经干细胞，使视网膜再生成为一种可能。这些细胞来源包括视网膜缘的干细胞、睫状体和虹膜的色素细胞、睫状体的非色素细胞和视网膜内的Müller细胞[1]。最近证实，哺乳动物的Müller细胞具有干细胞特性。Müller细胞是视网膜中的主要胶质细胞，在正常情况下，Müller细胞无干细胞特性，主要为视网膜神经元提供营养支持，维持细胞外环境的稳定，调节血视网膜屏障；在病理情况下，一方面介导视网膜神经元损伤的信号传递，另一方面保护视网膜神经元，甚至去分化，具有干细胞性质，部分替代损伤的视网膜神经元[2]。我们采用成年大鼠，寻找来源更容易，得率更高的视网膜干细胞获得方法。
1材料和方法
1.1材料 所用6周龄成年VC大鼠购自第三军医大学大坪医院动物中心。首先，100g/L水合氯醛按3～4mL/kg ip麻醉大鼠，固定鼠体位，常规局部消毒、表面麻醉、铺巾，10μL微量进液器于右眼经睫状体扁平部向玻璃体腔内注射含有神经毒素NMDA（40mmol/L/眼）、KA(4mmol/L/眼)（Sigma公司）和生长因子FGF2（20ng/眼）,insulin（1μg/眼）的混合液5μL。左眼玻璃体内注射PBS 5μL作为对照组。术后1wk剜出眼球。取部分处理组和对照组眼球用于免疫组化切片。其余眼球用含有双抗的DHanks液冲洗多遍，DMEM/F12（Hyclone公司）培养基中孵育过夜。移入超净台，解剖显微镜下去除眼前节，剥取视网膜，小心剪除周边视网膜，注意避免被视网膜色素上皮和睫状体上皮污染。将视网膜剪碎，用1g/L的胰蛋白酶消化25min，加入含150mL/L胎牛血清的培养基终止消化。反复吹打成细胞悬液，经200目筛网过滤后800～1000r/min离心5min，弃上清液，用配好的DMEMF12培养液（含150mL/L胎牛血清、100kU/L青霉素、链霉素）吹打悬浮，移至25cm2培养瓶中，于37℃ 50mL/L CO2培养箱内贴壁培养。24h后，去上清液及未贴壁细胞，换液1次。观察培养约5～7d，隔天换液，待细胞生长形成融合状态时，2/3换以新鲜培养液，放入37℃的恒温摇床内，300r/min摇24h。弃上清液，DMEMF12培养基冲洗2遍，备用。
图1 细胞爬片的免疫荧光组化结果显示：毒素刺激后的Müller细胞Nestin表达阳性（略）
1.2方法
1.2.1细胞免疫荧光组化 细胞爬片免疫荧光组化：将培养在六孔板盖玻片上的Müller细胞用1×PBS洗涤2次×5min，40g/L多聚甲醛固定15min， PBS洗涤3次×5min，3g/L TritonX100破膜20min，PBS洗涤3次×5min，吸干。封闭30min，立即吸干。加一抗，阴性对照用PBS代替一抗，4℃湿盒过夜。PBS洗涤3次×5min，吸干。加RPE标记的二抗，4℃避光2h，PBS洗涤3次×5min，吸干。缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。
1.2.2流式细胞分析 将所得处理后Müller细胞均分为3管，每管约1×106个细胞，分为空白对照管、二抗对照管和样品管，另设一管加入相同数量的正常Müller细胞，作为同型对照。悬液离心，去上清液，1×PBS冲洗并混悬，1200r/min离心5min，弃上清液，反复3次。每管各加入固定液（eBioscience公司）500μL，混匀固定，静置25min。加1×PBS液在室温下1200r/min离心5min，反复2次，洗去固定液。各管分别加入细胞膜裂解液（eBioscience公司）1mL，震荡混悬，1200r/min离心5min，弃上清液，反复3次。在同型对照管和样品管中加入一抗（Chemicon公司）1μg,震荡混匀，静置1h。加入细胞膜裂解液洗3次，洗去未结合一抗。在二抗对照管、同型对照管和样品管中分别加入RPE标记的二抗（Abcam公司），震荡混匀，室温避光静置染色30min。加入细胞膜裂解液洗3次，洗去未结合二抗。去上清液，加入PBS调至每管含液体约500μL，上流式细胞分析仪检测。
2结果
2.1 Müller细胞原代培养 原代取材的视网膜Müller细胞，最初悬浮于培养液内，4h后开始出现细胞贴壁。36h后出现部分贴壁细胞向周围进行迁移。48h后细胞团内有细胞迁出。约在第6～7d，迁出的细胞形成融合状态,细胞形成2层，下层为扁平且折光性弱的多角形细胞，其上为胞体较小、折光性强且带有突起的细胞。形态学判断，下层扁平多角形细胞为Müller细胞，上层细胞则为不易贴壁且贴壁不牢的小胶质细胞和极少量残留神经元细胞。培养期间隔天换液可将漂浮的及贴壁不牢的细胞洗掉，剩下的细胞则绝大多数为Müller细胞，但是不能完全将贴壁在Müller细胞上层的混合性视网膜细胞清洗干净。当细胞生长到融合状态时，上恒温摇床震荡，可将附着于Müller细胞上层的其他细胞清除，从而获得纯度极高的Müller细胞，流式分析表明，表达Müller细胞标志物（glutamine synthetase,GS）的细胞占总细胞的96.1%。
2.2神经干细胞特性 细胞爬片的免疫荧光组化结果显示，刺激后的Müller细胞nestin表达阳性（图1），而未经刺激的Müller细胞上未见nestin蛋白表达。流式细胞分析结果显示，表达nestin蛋白荧光阳性细胞占样品管中细胞总数量的53.5%；占空白管中细胞的0.25%；占二抗对照管中细胞的0.95%；占同型对照管中细胞的1.54%。
3讨论
为了研究神经毒素刺激后的成年哺乳动物视网膜Müller细胞是否会产生神经干细胞特性。首先我们需要获得高纯度的Müller细胞。为此，联合采用了Das等[3]的视网膜取材方法和Gou等[4]的恒温摇动法纯化培养细胞。流式细胞分析结果显示，我们培养的Müller细胞纯度可达96%以上。镜下形态学观察，细胞污染主要为少量的小胶质细胞和极少量的星形胶质细胞，而这两种细胞已经被证明在本实验刺激条件下不具有神经干细胞特性[3]。所以我们认为，所得结果可以被看做是完全由Müller细胞的特性变化所产生的。Fisher等[2]用NMDA在体刺激哺乳动物的视网膜，可以使视网膜中央部细胞大量增殖。BrdU和谷氨酰胺合成酶（GS）/波形蛋白双标显示其为Müller细胞。在此基础上，2006年Das等[3]利用神经毒素混合液（包含NMDA，kainate，FGF2和insulin）成功启动正常哺乳动物中视网膜Müller细胞的神经干细胞特性。使其表达Chx10，Pax6和Six，nestin等多种干细胞标记物。并通过诱导实验证明，所得Müller细胞可以被诱导培养为其它视网膜终末神经细胞，从而证实哺乳动物Müller细胞具有潜在的神经干细胞特性。我们采用Das等[3]的方法刺激Müller细胞，用nestin（nestin是VI型中间丝蛋白，主要在中枢神经干细胞和胰岛前体细胞的细胞中表达，是目前最常用的神经干细胞标志物）的特异性抗体标记具有神经干细胞特性的Müller细胞。流式分析结果显示，处理后的Müller细胞神经干细胞标记物nestin的表达可达53.5%，而同型对照组中nestin的表达仅有1.54%，二者差异显著，有显著的统计学意义；细胞免疫荧光组化显示刺激后培养的Müller染色阳性。以上结果均证明我们成功激活了Müller细胞，并使其表达神经干细胞特性。
以视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）为代表的导致视网膜感光细胞受损的疾病是眼科十分常见的一组致盲性眼病，迄今没有满意的治疗方法。其中，光感受器细胞（photoreceptor cell，PRC）的变性、死亡，直至最后消失是该类疾病的主要病理特征。如何延缓、逆转感光细胞的死亡，甚至替换死亡的光感受器细胞对该类疾病的治疗具有重要价值。目前，国内外视网膜干细胞移植的研究多集中在利用胚胎干细胞或视网膜成体细胞。与胚胎干细胞相比，作为视网膜原有细胞的Müller细胞成瘤性小管且不涉及移植伦理学问题；与其他成体干细胞相比，作为视网膜主要滋养细胞的Müller细胞能够分泌bFGF，CNTF和TGFa等多种细胞因子[5]，并且已有实验证明这些细胞因子对视网膜色素变性具有一定营养治疗作用[6,7]。所以，具有神经干细胞特性的Müller移植对视网膜变性疾病的治疗具有其独特的优势，我们旨在为该设想提供实验基础。同时，Müller细胞作为视网膜的一种终末细胞，其受刺激后转变为神经干细胞的特性可以为我们进一步了解视网膜成体干细胞的形成和转化条件提供一个经典的细胞模型。下一步，如果能够通过研究Müller细胞从成体细胞向神经干细胞转化中起关键调控作用的信号转导通路，找到或发现能够有效调控该过程的小分子物质，将不但能够为临床治疗视网膜变性性疾病提供一种新的治疗手段，而且将初步揭开视网膜成体干细胞的面纱，为干细胞治疗带来新的曙光。
【参考文献】
1 Fischer AJ. Neural regeneration in the chick retina. Prog Retin Eye Res 2005;24(2):161182
2 Fischer AJ, Reh TA. Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina. Nat Neurosci 2001;4(3):247252
3 Das AV, Mallya KB, Zhao X, et al. Neural stem cell properties of Müller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev Bio 2006;299(1):283302
4 Gou L, Zhang ZM, Xu HP, et al. A technique study on the purification culture of rat retinal Müller cells with constanttemperature shaking. Chin Ophthalmic Res 2002;20(5):411413
5 Nishida A,Takahashi M, Tanihara H, et al. Incorporation and differentiation of hippocampusderived neural stem cells transplanted in injured adult rat retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41(13):42684274
6 MacDonald IM, Sauvé Y, Sieving PA. Preventing blindness in retinal disease:ciliary neurotrophic factor intraocular implants. Can J Ophthalmol 2007;42(3):399402
7 Lau D, McGee LH, Zhou S, et al. Retinal degeneration is slowed in transgenic rats by AAVmediated delivery of FGF2. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41(11):36223633
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