作者：林芳，高晓唯，任兵，肖云，杨玉洁
作者单位：(832002)中国新疆维吾尔自治区石河子市,石河子大学医学院;(830011)中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,解放军第四七四医院眼科中心
【摘要】目的：探讨Avastin对角膜新生血管形成及角膜内血管内皮生长因子(VEGF)的影响及其超微结构的影响。方法：Wistar大鼠96只随机分3组，采用碱烧伤的方法制备大鼠角膜新生血管模型;正常不烧伤组4只。烧伤后隔日球结膜下注射0.1mL生理盐水组32只，烧伤后隔日球结膜下注射Avastin 0.1mL组32只,烧伤后隔日球结膜下注射地塞米松0.1mL组32只。碱烧伤术后在裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜混浊度；宏观测量新生血管长度；组织病理切片HE染色作微血管计数；透射电镜观察超微结构的改变；免疫组化检测角膜VEGF的蛋白表达情况； CD34标记新生血管，显微镜下微血管计数方法研究角膜新生血管形成及抑制情况。结果：治疗组在3,7,10,14d较对照组角膜混浊程度轻（P<0.05）；14d形成的新生血管数量较对照组少（P<0.05）。实验组新生血管微血管数量减少, VEGF蛋白表达下降,具有统计学差异。VEGF主要表达在角膜受损区的感染细胞胞质内，其出现时间与位置与角膜新生血管一致。Avastin和地塞米松均可有效抑制角膜新生血管，减少角膜内VEGF表达，两者无统计学差异，结膜下注射Avastin和地塞米松后，大鼠角膜超微结构无除烧伤后其它显著改变。结论：Avastin和地塞米松可抑制角膜新生血管,减少角膜内VEGF表达，对角膜的超微结构均无显著毒性。
【关键词】 阿瓦斯丁 角膜 新生血管 血管内皮生长因子
0引言
正常角膜内无血管,也无淋巴管,这是维持角膜透明和角膜免疫赦免的必要条件。一些病理状态打破了保持角膜无血管的平衡因素,毛细血管便会从角膜缘血管网侵入角膜,使新生血管生成占据主导地位。眼部新生血管常在眼部微生物感染、机械损伤、化学伤和某些自身免疫病等情况下发生，是较为常见的病理改变，常伴随出血、渗出及增生等病变，导致眼正常结构和功能的破坏，甚至造成严重的视功能损害。角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)的形成严重影响角膜透明性,是最常见的致盲原因之一,也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。抗VEGF药物大量研究表明, CNV的形成与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的过度表达密切相关。针对VEGF自身及其信号转导通路的抗VEGF治疗药物已成为当今的研究热点,主要包括抗VEGFmAb、抗VEGF适体、VEGFTrap及VEGFR酪氨酸激酶抑制剂[1]。抗VEGFmAb贝伐单抗Bevacizumab,又称rhuMAbVEGF，商品名Avastin，是人源化的抗VEGF重组鼠mAb。贝伐单抗对VEGFA的所有亚型都具有亲和力,其抗新生血管的主要机制为阻止VEGF与内皮细胞表面的VEGFR1和VEGFR2受体结合,阻止血管渗漏和新生血管的形成,从而使内源化VEGF的生物活性失效。我们应用Avastin球结膜下注射的方式对碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管进行治疗并在透射电镜下观察其对角膜超微结构的影响，为Avastin治疗角膜新生血管奠定基础。
1材料和方法
1.1材料 清洁级成年雄性Wistar大鼠100只，体质量180～220g，鼠龄6～8wk。饲养条件：清洁、通风、温度及湿度相对恒定、混合饲料单独笼养。贝伐单抗Bevacizumab,商品名Avastin，购自罗氏公司。
1.2方法 戊巴比妥钠注射液100g/L按1.5mL/kg麻醉大鼠。4g/L盐酸奥布卡因表面麻醉，阿托品散瞳。瞳孔散大后，常规消毒，棉签拭去结膜囊内多余水分，将直径3.0mm的圆形滤纸浸于1mol/L的NaOH溶液中20s达饱和，甩去多余碱液，立即准确贴于角膜中央40s，取下滤纸，用60mL生理盐水冲洗2min，涂迪可罗眼膏后每日阿托品散瞳。A组：对照组，不做处理;B组：角膜碱烧伤后球结膜下注射生理盐水0.1mL，隔日1次;C组：角膜碱烧伤后0.1mL球结膜下注射Avastin，隔日1次;D组：角膜碱烧伤后球结膜下注射0.1mL地塞米松，隔日1次。
1.2.1角膜情况观察 显微镜裂隙灯下观察烧伤后结膜、角膜及新生血管情况。观察角膜上皮缺损情况、角膜水肿、混浊、前房深度、前房积血、瞳孔情况，并记录。角膜水肿根据角膜水肿在上皮、浅层基质和全基质分为轻、中、重度水肿；角膜混浊程度按照Yamada等[2]的角膜混浊度评分标准记录。
1.2.2角膜新生血管定量 分别在烧伤后3,7,10,14d，对角膜用裂隙灯显微镜观察、照相。根据角膜照片测量并记录从角巩膜缘长出的新生血管长度，计算角膜新生血管的生长面积。计算面积公式依据Robert电脑教学模式计算：S=C/12×3.1416[r2(rl)2]，其中C代表角膜血管网所占的钟点数，l代表新生血管的生长长度，r代表角膜半径[3]。
表1 大鼠角膜碱烧伤后角膜混浊情况（略）
表2 各组大鼠角膜碱烧伤后新生血管的面积比较（略）
1.2.3病理免疫组织化学检查 将实验大鼠于碱烧伤后3,7,10,14d分别取材，动物深麻醉后，剪开结膜囊，眼科剪剪断视神经及血管，迅速置于盛有25g/L戊二醛溶液的清洁器皿中，于角膜缘后2mm处1mL注射器注入少量25g/L戊二醛溶液，使眼球呈饱胀状，并于角膜缘多处平行轴线切开约1～2mm的小口，25g/L戊二醛溶液中固定20min，在固定液中用显微剪沿角膜缘外1mm剪下角膜组织，固定液中小心去除虹膜组织，沿直径方向把角膜分成两半，一半40g/L中性磷酸盐缓冲液甲醛（400g/L甲醛∶PBS＝1∶9）固定16～24h行病理学及免疫组织化学检查，另一半固定于25g/L戊二醛溶液中，待行透射电镜检查。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。
2结果
2.1裂隙灯角膜混浊度观察 碱烧伤后大鼠角膜即刻出现肉眼可见的混浊、水肿，1d混浊有所减轻（I～II度混浊），但此后逐步加重，在7～8d时混浊、水肿发展至高峰期（III～IV度混浊）。这之后混浊程度稍有减轻，基本稳定。治疗组和对照组比较，在术后1d无明显差异，但在此后逐渐出现差异，C组和D组在中后期角膜混浊度均较轻，与对照组比较差异有显著性（P<0.05，表1）。
2.2角膜新生血管测量 各实验组新生血管在烧伤后24h出现细小新生血管，之后B组新生血管面积不断增加，至10d新生血管面积达高峰，后生长速度变慢；C,D组新生血管面积7d后减小，血管变稀疏，逐渐退化。14d角膜新生血管生长情况见图1AC。C,D组在碱烧伤后各时间点新生血管面积均小于B组，C,D组与B组新生血管面积的差异有统计学意义（P<0.05）。D组较C组对新生血管的抑制作用略强，差异无统计学意义(表2)。
2.3角膜组织学检测 A组角膜组织各层结构完整，排列紧密，角膜全层内无血管；碱烧伤术后第3d B组角膜缘处新生血管数量较多，部分管腔内可见红细胞，呈扩张状态，由角膜缘逐渐向角膜中央生长；C，D组角巩膜缘处少量毛细血管扩张，均未见明显新生血管芽。术后7d B组新生血管从周边向中央延伸至大部分角膜基质层，浅基质层内已见较多新生血管，单层内皮细胞围绕形成毛细血管腔，管腔内可见大量红细胞；C,D组角膜缘处可见正在生长的血管芽，未见成熟血管。术后10d B组角膜上皮细胞基底细胞可见少量缺失，不同程度异常增生和上皮缺失，周边角膜上皮基底细胞形成很多空泡，角膜组织水肿明显,组织结构疏松，可见角膜基质前2/3炎性细胞浸润，其间有成熟的新生血管，角膜内皮细胞排列疏松，内皮细胞数减少；C,D组角膜上皮结构较紧密，可见接近正常的上皮细胞层析和形态，基质内炎性细胞浸润较少，主要集中于浅基质层，基质板层排列较紧密，浅基质层和上皮细胞层可见角膜新生血管管腔较小，密度低，内皮细胞较紧密。术后14d B组角膜基质层内可见大量成熟新生血管，管壁由单层平滑肌构成，管腔粗大，内有成熟红细胞，部分新生血管已达角膜中央。此后新生血管基本稳定，较短、细小的血管稍有消退。C,D组角膜浅基质层内单层内皮细胞围绕形成新生毛细血管管腔，管腔内少量红细胞，管径较小，分布稀疏。治疗组与对照组比较，新生血管出现迟，形成数量少。B组在角膜碱烧伤后第14d角膜上皮细胞基底细胞可见少量缺失，不同程度异常增生和上皮缺失，周边角膜上皮基底细胞形成很多空泡，角膜组织水肿明显,组织结构疏松，可见角膜基质前2/3炎性细胞浸润，其间有较密集的新生血管，角膜内皮细胞排列疏松，内皮细胞数减少；C,D组在角膜碱烧伤后第14d角膜上皮结构较紧密，可见接近正常的上皮细胞层析和形态，基质内炎性细胞浸润较少，主要集中于浅基质层，基质板层排列较紧密，浅基质层和上皮细胞层可见角膜新生血管管腔较小，密度低，内皮细胞较紧密（图2AC）。
图1 角膜新生血管（略）
A：B组；B：C组；C：D组
图2 角膜组织学检测（略）
A:C组；B:烧伤后14d角膜新生血管(HE×400)；C：NS组（B组）
图3 VEGF阳性细胞(SP×400)（略）
A：NS组；B：C组；C：D组
2.4免疫组化检测结果 A组正常角膜上皮层、浅基质层及内皮层细胞有VEGF的弱阳性着染，B组角膜上皮层、浅基质层、内皮层及角膜CNV内皮细胞VEGF阳性细胞数较A组增多，C,D组阳性细胞数较B组明显降低，但较A组增多。各组角膜VEGF阳性细胞数分别为:A组（49±3.1）、B组（86±3.0）、C组（68±4.1）及D组（62±3.8）（图3AC），各组间两两比较，除C,D组间差异无统计学意义，其余各两组间差异有统计学意（P<0.05）。A组正常角膜上皮层、浅基质层及内皮层细胞无CD34的阳性着染，B组角膜上皮层、浅基质层CD34+细胞数较B组增多，C,D组阳性细胞数较B组明显降低，但较A组增多。各组角膜CD34+细胞数分别为: B组（10±1.2），C组（4±0.7）及D组（3±0.6）（图4AC），各组间两两比较，除C,D组间差异无统计学意义，其余各两组间差异有统计学意义（P<0.05）。
2.5透射电镜观察 碱烧伤术后3d，大鼠角膜上皮层细胞分层、脱落、坏死，胞质空化、溶解；基质层水肿，弹性纤维分散；内皮细胞肿胀、坏死、脱落，细胞之间连接疏松，桥粒数量减少，间隙明显增宽。基质层有成纤维细胞调亡：部分胶原排列走向乱且稀疏。内皮细胞层脱落。C,D组较对照组程度轻。术后7d，上皮细胞胞质肿胀，核轻度扩张，桥粒较多，但细胞间隙仍较大，基质层可见较多红细胞，内皮细胞未见，内弹力层裸露。C,D组上皮细胞形态大致正常，而B组上皮细胞有多层坏死；胞质空化，核肿胀，线粒体固缩。碱烧伤后14d，A组正常角膜，各层细胞间连接紧密，结构正常。B组角膜上皮细胞间水肿，结构疏松，细胞间连接破坏，细胞核染色质浓缩，基质层水肿，弹性纤维分散，角膜细胞凋亡：部分胶原排列走向乱且稀疏。基质层可见密集的新生血管管腔，管腔结构完整，血管内皮细胞新生血管内皮细胞幼稚、核大、胞质丰富，可见内皮细胞呈现多足，在管腔内移行。角膜内皮细胞胞核染色质浓缩边际，少数出现碎片，桥粒连接变少，细胞间间隙较大，细胞内细胞器减少，可见较大空泡。C,D治疗组上皮细胞胞质肿胀，核轻度扩张，核染色质分布均匀，细胞间连接紧密，桥粒较多，细胞内少量空泡出现，基质排列紧密，少见新生血管管腔，血管内皮细胞核染色质边际，致密，凝集成小团块，部分断裂成小碎片，细胞膜皱缩、凹陷，胞质内出现较多空泡（图5）。
图4 CD34+细胞(SP×400) （略）
A:C组；B:D组可见少量角膜新生血管，CD34+细胞；C：B组
图5 大鼠角膜超微结构(TEM×2500)（略）
A：正常；B：烧伤无处理；C：烧伤3d地塞米松；D：烧伤3d Avastin；E：烧伤7d地塞米松；F：烧伤7d Avastin；G：烧伤10d地塞米松；H：烧伤10d Avastin
[1] [2] 下一页 |
