作者：岳红云，贺翔鸽，燕振国，马岩梅
作者单位：（730050）中国甘肃省兰州市，兰州军区兰州总医院眼科；（400042）中国重庆市，第三军医大学大坪医院眼科
【摘要】 目的：分析Nogo66蛋白的氨基酸序列特征，分析其产生免疫应答的机会。方法：ProPred web interface程序，ProPred MHCII Binding Peptide prediction Server抗原表位分析软件，对Nogo66蛋白进行分析,查找T细胞抗原表位，分析分子量及氨基酸残基特征。结果：Nogo66蛋白有6个重复率最高的T淋巴细胞受体识别的抗原表位: LGHVNCTIK VQKYSNSAL LVQKYSNSA LRRLFLVDD YKGVIQAIQ FLVDDLVDS，铆钉残基明确。结论：Nogo66蛋白的氨基酸序列决定了其可能具备免疫原性，具有刺激免疫系统产生T淋巴细胞介导的免疫反应的分子基础。
【关键词】 Nogo 66蛋白 氨基酸序列 神经免疫保护
0引言
中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤与修复过程中，Nogo因子不仅抑制神经纤维再生，而且Nogo基因表达上调可促进神经元凋亡和死亡的发生。Nogo蛋白的碳端和氮端在细胞膜内，而胞膜外由66个氨基酸残基形成拓扑结构—Nogo66，Nogo66通过与细胞表面受体NgR的配体受体式结合，介导了Nogo的中枢神经抑制活性。由于Nogo66为损伤后大量表达的内源性损伤因子。重组Nogo66蛋白如果能够激活特异性T淋巴细胞，则可成为神经损伤后的特征性免疫保护抗原。根据Nogo66蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析其分子特征，预测Nogo66蛋白的T淋巴细胞抗原表位。从而初步判断Nogo66蛋白可能与MHCII分子结合的程度及其提呈抗原表位肽段激活T淋巴细胞，产生免疫应答的机会。为利用Nogo66蛋白进行神经免疫保护的进一步实验提供依据[1]。
1材料和方法
1.1材料 重组基因表达得到的Nogo66蛋白与文献氨基酸序列相同，其中有3个酪氨酸残基，1个苯丙氨酸残基：RIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSN SALGHVNCTIKELRRLFLVDDLVDSLK。分子量：7.53461kDa。
1.2方法 预测T淋巴细胞抗原表位所应用的程序：ProPred web interface程序，ProPred MHC ClassII Binding Peptide Prediction Server抗原表位分析软件。 预测抗原序列中的MHC ClassII接合区域，通过预测抗原的氨基酸/位置系数，根据Sturniolo等（1999）推论出的线性预测模型，即基于预测方式的定量矩阵。得出已知抗原的等位基因特异性接合区域。确定抗原的定位泛宿主性的(质粒广谱宿主性)或等位基因特异性结合范围。选择最低假阳性率结果，忽略最高假阴性率，确定1%为筛选几率。确定锚钉蛋白位置。
2结果
应用ProPred MHC ClassII Binding Peptide Prediction Server抗原表位分析软件分析Nogo66蛋白的T细胞抗原表位如下：（略）
结果可知，Nogo66蛋白的T细胞抗原表位在针对人MHC ClassII分子的51个等位基因中，Nogo66蛋白有LGHVNCTIK VQKYSNSAL LVQKYSNSA LRRLFLVDD YKGVIQAIQ FLVDDLVDS 6个重复率最高的T细胞抗原表位，上述抗原表位的锚钉残基（黑体）能够针对人MHC分子结合，启动免疫应答。即Nogo66蛋白具有明确的抗原性，为免疫原性较高的蛋白质。锚钉残基的位置为斜体显示的氨基酸位点。
3讨论
神经免疫保护研究发现，通过眼内损伤部位大量增多的免疫原性物质进行免疫接种，能够有效激活特异性T淋巴细胞介导的保护性自身免疫反应，对损伤神经元进行免疫保护[2,3]。T淋巴细胞介导的免疫反应能够保护处于边缘性损伤的神经节细胞[4]。我们前期通过基因重组表达的Nogo66蛋白，其氨基酸序列与内源性Nogo66蛋白完全相同，如果具备免疫原性，则有可能成为介导损伤的内源性Nogo66蛋白的竞争性抑制抗原[5]。发挥抑制—抑制的神经保护作用。另外，通过对细胞免疫的激活，产生针对损伤抗原Nogo66的特异性T淋巴细胞[6]，产生特异性的T淋巴细胞介导的神经免疫保护。
具有免疫原性的外源性蛋白质多为分子质量>5000Da的蛋白质。但是，如果在氨基酸长链中加入酪氨酸和苯丙氨酸，当蛋白质的分子量达到4000Da时，即可显示免疫原性。基因重组表达得到的Nogo66氨基酸序列与文献氨基酸序列相同，钛链中包括3个酪氨酸残基，1个苯丙氨酸残基。其分子量为7534.61kDa。
蛋白质分子中能够被MHC分子提呈并且被T淋巴细胞受体(T cell receptor，TCR)识别的肽段称为T细胞表位(T cell epitope)[7]。抗原表位是提呈给T淋巴细胞并激活后者的特殊肽段。针对外来抗原T淋巴细胞在诱导免疫应答的过程中起到关键作用，抗原固有肽段中某些片断必须能够与T细胞主要组织相容性抗原(major histocompability complex，MHC)分子结合[8]。通过抗原表位分析，可知，Nogo66蛋白有6个重复率最高的T细胞抗原表位，存在与MHCII系统紧密结合的铆钉蛋白位置。有刺激免疫系统产生T淋巴细胞介导的免疫反应的分子基础。
慢性高眼压损伤后的视网膜有广泛的Nogo蛋白表达，并与损伤程度密切相关[9]。重组Nogo66蛋白是否具有免疫原性决定其能否通过Nogo66蛋白接种，增强特异性T淋巴细胞介导的免疫反应，达到对受损的RGCs保护作用[10]。因此，通过对Nogo66蛋白的氨基酸序列分析，对于进一步研究Nogo66蛋白的神经免疫保护作用，为青光眼的治疗提供新的神经保护思路，具有重要意义。
【参考文献】
1岳红云，贺翔鸽，谢琳.Nogo66蛋白的免疫原性研究.中华眼科杂志 2008;44(6):565567
2 Yang J, Patil RV, Yu H, et al. T cell subsets and sIL2R/IL2 levels in patients with glaucoma. Am J Ophthalmol 2001;131(4):421426
3 Moalem G, LeibovitzAmit R, Yoles E, et al. Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy. Nat Med 1999;5(1):4955
4 Lenzlinger PM, Shimizu S, Marklund N, et al. Delayed inhibition of NogoA does not alter injuryinduced axonal sprouting but enhances recovery of cognitive function following experimental traumatic brain injury in rats. Neuroscienc 2005;134(3):10471056
5 Walmsley AR, Mir AK, Frentzel S. Ectodomain shedding of human Nogo66 receptor homologue1 by zinc metalloproteinases. Biochem Biophys Res Commun 2005;4(327):112116
6 Al Halabiah H, Delezoide AL, Cardona A, et al. Expression pattern of Nogo and NgR genes during human evelopment. Gene Expr Patterns 2005; 5(4):561568
7周光炎.免疫学原理.第1版.北京:科学技术出版社 2005：107109
8龚非力.医学免疫学.第1版.北京:人民卫生出版社 2004：113114
9马建洲，贺翔鸽，谢琳,等.慢性高眼压青光眼动物模型的构建和鉴定.国际眼科杂志 2007；7（4）：12031205
10马建洲，贺翔鸽.免疫系统与青光眼.国际眼科杂志2007;7(5):13791383
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