作者：邓宏伟，姚晓明，齐卫
作者单位：（518001）中国广东省深圳市，暨南大学附属深圳市眼科医院
【摘要】目的：观察表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)与纤维蛋白封闭剂复合物对碱烧伤后眼表结构修复影响。方法：应用5mm直径滤片吸附1mol/L NaOH，烧伤大鼠角膜1min所造的鼠角膜碱烧伤模型，并在烧伤后采用EGF与纤维蛋白封闭剂复合物平铺在受伤的角膜表面，并在烧伤后1，2，4wk处死各组动物，通过HE染色和免疫组化染色在光学显微镜下观察各组角膜新生血管形成情况，以及TNFα，IL6，IL8表达情况,并行对照分析。结果：烧伤后使用EGF与纤维蛋白封闭剂复合物平铺在受伤的角膜表面组角膜新生血管和多种细胞炎症介质在烧伤后1，2，4wk均明显少于烧伤组。结论：EGF与纤维蛋白封闭剂复合物显著促进角膜烧伤后角膜上皮的形成
【关键词】 表皮生长因子 纤维蛋白封闭剂 角膜 碱烧伤
0引言
表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种强有力的细胞分裂促进因子，可以促进创伤愈合和组织修复[1,2]。纤维蛋白封闭剂（fibrin sealant, FS），别名叫纤维蛋白胶或叫纤维蛋白组织胶粘剂，现在蛋白胶已发展成一个家族，有各种各样的蛋白胶，如胶原蛋白、白蛋白、弹性蛋白，合成多肽等蛋白胶，能适应各种各样的要求。纤维蛋白封闭剂可对干细胞，成纤维细胞，软骨细胞等细胞和组织进行三维捆绑，在修复和再生医学中发挥作用，并且可作为载体，把药物和各种有治疗作用的活性物质传递到身体内外的几乎任何位置。我们应用纤维蛋白封闭剂作为药物载体、阻止组织进一步损伤、加快创伤愈合和可降解的作用，将表皮生长因子与纤维蛋白封闭剂形成复合物应用于碱烧伤后眼表组织的修复，为临床早期治疗碱烧伤提供新的手段。
1材料和方法
1.1材料 EGF冻干粉在无菌条件下，以去离子水配制成40mg/L浓度，20℃保存备用。纤维蛋白封闭剂由广州倍绣生物技术有限公司购买。Wistar大鼠80只，体质量250～260g，购自第一军医大学动物中心，普通级。随机分为正常对照组和碱烧伤组，其中正常空白对照组6只，碱烧伤组72只。所有动物均选择右眼为实验眼，角膜烧伤后再根据烧伤后不同处理手段分为4组（碱烧伤后未处理组、立即使用纤维蛋白封闭剂组、使用表皮生长因子改良纤维蛋白封闭剂组、使用表皮生长因子组），每组18只，在烧伤后1，2，4wk分别每组处死6只，进行免疫组化检测。兔抗大鼠mAbTNFα，IL6，IL8由DACON提供，羊抗兔血清，过氧化酶标记的免疫组化二步法试剂盒[DACON EnVision TM试剂盒（兔/鼠双标）]。
表1 大鼠角膜烧伤后BI评分（略）
aP<0.05 vs A，B，C，E组
1.2方法 大鼠100g/L水合氯醛6mL/kg, ip麻醉后，取直径为5mm的单层滤纸，浸入到1mol/L NaOH中10s，将浸碱的滤纸贴在大鼠双眼角膜中央部60s，除去滤纸，用生理盐水冲洗5min。分组：A组：空白对照组（无烧伤）；B组：烧伤对照组，建立烧伤模型后不处理组；C组：烧伤后立即使用纤维蛋白封闭剂组；D组：烧伤后立即使用EGF改良的纤维蛋白封闭剂组；E组：烧伤后立即使用EGF，1次/d。各组分别于处理后1，2，4wk处死大鼠，于角膜缘外剪取角膜，置于40g/L甲醛溶液中固定、脱水、包埋。各组在处理后1，3d；1，2，4wk的裂隙灯显微镜下角膜透明度、水肿度、新生血管度情况，参考Holland等[3]制定的标准，记录角膜混浊、水肿和新生血管3项评分之和为烧伤指数（burn index，BI）。HE和免疫组化染色，Nikon显微镜下观察。阴性对照以PBS代替兔抗大鼠TNFα,IL6,IL8抗体，方法照旧。抗体染色阳性的细胞表现为胞质程度不同、基本均匀的棕黄色粗大颗粒反应，反之则为染色阴性。实验组和对照组每组取5张切片，每张切片在角膜部位随机取5个视野(400倍)作图像分析，计算5张切片的平均吸光度，作为该组阳性细胞的平均吸光度，用(±s)表示。
统计学分析：用SPSS 11.0统计软件，对实验结果进行统计学分析。依据资料性质进行卡方检验。P<0.05有显著性差异。
2结果
2.1大鼠角膜情况 裂隙灯下观察A组正常角膜上皮光滑，未见新生血管。B组：角膜上皮层在术后发生上皮缺损，形成慢性持续性上皮缺损；烧伤后4d新生血管多从下方和上方向角膜中央延伸，后覆盖整个角膜，多位于角膜的浅基质层，角膜烧灼区呈半透明水肿。C组：烧伤后第7d可见有新生血管自角膜缘长入角膜，烧伤后2wk角膜中央保持无血管。D组：烧伤后第2wk可见有少量新生血管自角膜缘长入角膜（表1）。
2.2免疫组织化学染色 烧伤后B组在1wk时可见大量的新生血管组织，TNFα,IL6,IL8阳性细胞多见于角膜基质层和内皮细胞层（图1A），角膜上皮有溃疡。D组在烧伤后同一时间，角膜基质细胞阳性表达明显少于B组（图1B）。计算机图像分析D组各时段与B组相比炎症细胞阳性表达明显减少(P<0.05，表2)。
表2大鼠角膜碱烧伤后TNFα，IL6，IL8平均光度（略）
aP<0.05 vs B组
图1 烧伤后1wk TNFα表达（SP×160）（略）
A：B组；B：D组
3讨论
纤维蛋白胶(fibrin glue，FG)是一种从人血浆中提取的生物制品，主要由凝血酶/Ca和纤维蛋白原/XIII因子等组成[4]。它模仿血液凝固的最后阶段，即在凝血酶和钙离子的作用下，纤维蛋白原分子激活，裂解出纤维蛋白肽A和肽B，形成纤维蛋白单体，同时激活因子参与纤维蛋白的交叉联结，使纤维蛋白固化物形成[5]。它是利用二次止血原理的止血剂，特点是粘合效果不受血小板减少等血液凝固障碍的影响；液体，适用于凹凸不平或部位较深的伤口，能促进创伤部位愈合，组织亲和性好，无毒。1960年以来，眼科学界对医用粘合剂的研究和使用日益增加。从目前的研究报道中看，医用粘合剂作为一种新的接合手段，在很多眼科手术中起到了替代缝合的作用，从而缩短了手术的时间，避免了术后拆线，减轻了因缝线引起的术后不适及其他并发症[6，7]。但是纤维蛋白胶的功能包括了封闭、生物止血、粘合作用、促进创伤组织愈合、防止组织粘连、缓释剂等功能。目前尚未见到临床利用其促进创伤组织愈合的功能应用到严重创(烧)伤后的创面修复，尤其是应用于治疗眼科碱烧伤治疗方面的相关报道。
本实验表明，严重烧伤后角膜基质细胞中TNFα增加，可能机制是：（1）缺血缺氧引起炎性细胞尤其是中性粒细胞(PMN)的激活，活化后的PMN可促使TNFα及氧自由基的生成。（2）在严重创伤应激情况下可激活NFκB，活化的 NFκB参与多种基因表达调控，特别是对调节炎性反应基因表达起至关重要作用。NFκB可高效诱导IL1，IL8和TNFα等细胞因子的表达。而TNFα又可促进NFκB激活。目前认为，TNFα，IL1，IL6诱发的炎症反应在很大程度上是通过诱导产生以IL8为代表的趋化因子所介导而产生的，且与病灶的大体炎症程度呈正相关。本实验亦证实IL8与TNFα，IL6的表达呈正相关。
我们将纤维蛋白胶应用于角膜碱烧伤创面观察烧伤后组织中的中性粒细胞等炎症细胞活化情况，以及炎症介质TNFα，IL6，IL8失控性释放情况，从而评价该纤维蛋白胶在促进角膜碱烧伤中的作用，并利用该生物胶的药物缓释作用将EGF因子混合到生物胶中改良生物胶的治疗碱烧伤的作用。实验结果表明，EGF与纤维蛋白封闭剂复合物显著促进角膜烧伤后角膜上皮的形成，阻挡新生血管的形成，是一种有治疗碱烧伤临床应用价值的复合物。
【参考文献】
1付小兵.生长因子与创伤修复．北京：人民军医出版社 1991：5764
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3 Holland EJ, Olsen TW, Sterrer J, et al. Suppression of graft rejection using 15deoxyspergualin in the allogeneic rat penetrating keratoplasty model. Cornea 1994;13(1):2832
4 Marque PE, Spuntarelli R, Juliano L, et al. The role of Glu(192) in the allosteric control of the S(2) and S(3) subsites of thrombin. J Biol Chem 2000;275(2)：809816
5 Brennan M. Fibrin glue. Blood Rev 1991;5(4):240244
6林博文，徐忠世，肖德明，等.头孢唑啉钠人纤维蛋白凝胶防治骨科感染的实验研究.中华创伤杂志 2005;21(3)：192 195
7殷香保，王捷，伍衡，等．丝裂霉素纤维蛋白胶凝胶化疗的缓释特性. 中山大学学报医学科学版 2004;25(6)：542545
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