作者：张米，尹天泉，刘源，金岩 ，胡丹
作者单位：(710032)中国陕西省西安市，第四军医大学西京医院眼科；（710032）中国陕西省西安市，第四军医大学西京消化病医院消化一科；（710032）中国陕西省西安市，第四军医大学口腔医学院组织工程研发中心
【摘要】目的：研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果。方法：制备晾干的脱细胞猪角膜基质，取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞，体外种植到脱细胞猪角膜基质上，培养3d后用于板层角膜移植。结果：板层角膜移植2mo后，术眼角膜基本恢复透明，未发生排斥反应，新生血管较少,3mo后新生血管基本消退。结论：复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力。
【关键词】 脂肪干细胞 脱细胞猪角膜基质 组织工程角膜 角膜移植 碱烧伤
0引言
角膜移植是重要的复明手段之一，然而角膜供体的缺乏和排斥反应大大限制了这一手术的开展[1]。而运用组织工程角膜等效物替代角膜供体，是解决这一问题的有效途径[2,3]。目前，组织工程角膜支架材料包括羊膜、天然胶原，以及一些高分子聚合物[4]；种子细胞主要包括角膜缘干细胞、皮肤上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞等。这些组织工程角膜可以修复角膜缺损，保持眼球的完整性，并在一定程度上恢复患眼的视力。由于天然角膜具有高度规则的胶原排列，集良好的透明度与弹性于一体，从而起到保护眼球，透光，屈光的作用。然而，在组织工程角膜的构建中，运用交联技术难以模仿天然角膜的构象。此外，由于角膜缘干细胞数量较少，尤其是取患者健侧眼的干细胞存在一定的风险，皮肤上皮细胞存在角化现象等问题，目前尚缺乏理想的组织工程角膜种子细胞。我们构建具有天然构象的组织工程角膜支架材料，寻找易于获得、易于分离培养、对角膜损伤具有修复作用的种子细胞。
图1 晾干的脱细胞猪角膜基质（略）
图2 第3代自体脂肪干细胞 （略）
图3 复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质（HE×10）（略）
图4 兔角膜碱烧伤模型及角膜移植（略）
A：角膜碱烧伤；B：移植术后角膜恢复透明；C：术后2mon无排斥反应
1材料和方法
1.1材料 健康新西兰大白兔10只，体质量2.0～2.5kg,不分雌雄，购于第四军医大学实验动物中心。右眼作为实验眼。将直径为6mm的圆形滤纸片，浸泡于1mol/L NaOH溶液中后，贴于兔角膜中心表面1min，移去滤纸片，大量生理盐水冲洗,造成角膜碱烧伤模型[5]，3d后，速眠新II注射液（长春军需大学兽医研究所），0.15mL/kg, im麻醉, 2.5g/L地卡因滴眼液表面麻醉，用直径9mm的环钻制备床及植片，进行板层移植，100缝线间断缝合。猪角膜购于当地屠宰场。
1.2方法 脱细胞猪角膜基质的制备参照我们实验室以前报道的方法[6]，为提高其透明度，加以改进。具体步骤为：取猪角膜前1/3板层（厚约300μm），在80℃下冷冻后，室温下融化，此冻融过程重复3次后，将其置于2.5g/L胰酶中浸泡25min，PBS清洗后置于DNA与RNA酶的混合液中15min，PBS清洗后置于1mol/L NaOH溶液中15min，PBS冲洗至中性，pH试纸检测，最后将角膜片置于培养皿底铺平，超净台中晾干。体外培养自体脂肪干细胞。具体步骤参照Zuk等[7]报道的方法。自体脂肪干细胞在脱细胞猪角膜基质上的接种。接种前，将脱细胞猪角膜基质在培养液（DMEM+100mL/L FBS）中浸泡3d，之后吸干培养液，在孵箱中放置2h。将第3代脂肪干细胞用2.5g/L胰酶进行消化，离心，用少量培养液吹打后，以5×104个/cm2的密度进行接种于aPACS的前弹力层表面，加入培养液，37℃，50mL/L CO2进行培养，3d后，用于板层角膜移植。移植2mo后，取全层角膜，HE染色，观察角膜结构。
2结果
改进方法后处理的去细胞猪角膜基质具有良好的透明度（图1）。第3代脂肪干细胞生长状态良好，呈短梭状（图2）。复合了自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质HE染色显示细胞在材料上生长状态良好，贴附紧密（图3）。碱烧伤后角膜水肿，混浊，色白，透明度差（图4A）。术后当时，角膜恢复透明（图4B）。2mo后，植片在植床上存活良好，无排斥反应，无化脓，未见明显的新生血管生成，透明度较术前显著提高（图4C）。除其中1只植片脱落外，其余9只均取得了良好的修复效果。HE染色显示植片与植床吻合良好，角膜基质细胞均匀的长入材料内，上皮细胞呈复层化生长，胶原排列整齐，呈板层状(图5)。
图5 2mo后角膜取材，植床与植片吻合良好，上皮呈复层化（HE×4）（略）
3讨论
组织工程角膜的研究与发展为角膜移植带来了新的希望，然而目前尚缺乏具备天然角膜高透明、良好的弹性等特点的组织工程角膜支架材料[8]。我们所制备的晾干去细胞猪角膜基质材料具有良好的透明度，对缝线切割具有良好的耐受性，保留了前弹力层，在去细胞的过程中没有破坏天然角膜胶原的规则排列，移植后未发生排斥反应，具有良好的生物相容性。特别是制备方法改进后透明度的提高，大大提升了其临床应用的潜力。
种子细胞是组织工程角膜研发领域中的另一重要问题，由于自体的角膜种子细胞来源有限，异体或异种来源的细胞存在免疫排斥的风险，近年来许多学者致力于寻找合适的组织工程角膜种子细胞[9]。干细胞具有多向分化的潜能及免疫抑制的功能，已在组织工程的领域得到广泛的应用，尤其是脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞具有易于获取和培养的特点，更是具有临床应用的潜力。已有运用异种脂肪干细胞原位注射修复角膜基质缺损，运用异种骨髓间充质干细胞与羊膜复合修复角膜化学烧伤的报道[7,10]。然而，注射细胞修复角膜基质缺损的方法具有其局限性，在重力和体位的作用下难以保持细胞的均一性，其修复的适应证范围也较小。而在体外制备细胞材料复合物后用于移植可以使细胞的分布密度得以控制，并且可以应用于较大范围的角膜缺损。
我们以晾干的去细胞猪膜基质作为支架材料，以自体脂肪干细胞做为种子细胞，成功的在体外构建了组织工程角膜，并应用于修复角膜碱烧伤模型。术后角膜恢复透明，未见明显新生血管生成，修复效果良好，证明脱细胞猪角膜基质具有良好的生物相容性；改进方法后制备的aPACS具有良好的透明度，脂肪干细胞与aPACS复合构建的组织工程角膜具有临床应用的潜力。此外，自体脂肪干细胞与猪角膜的易于获得性为其广泛应用提供可能。
【参考文献】
1 Whitcher JP, Srinivasan M, Upadhyay MP. Corneal blindness: a global perspective. Bull World Health Organ 2001;79(3):214221
2 Griffith M, Osborne R, Munger R, et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science 1999;286:21692172
3 Hu X, Lui W, Cui L, et al. Tissue engineering of nearly transparent corneal stroma. Tissue Eng 2005;11(1112):17101717
4 Liu W, Merrett K, Griffith M, et al. Recombinant human collagen for tissue engineered corneal substitutes. Biomaterials 2008;29 (9):11471158
5汪玲，吴洁，朱秀萍，等.角膜共焦显微镜早期诊断兔高危角膜移植排斥反应的价值.国际眼科杂志 2008;8(7):13341336
6 Zhang C, Nie X, Hu D,et al. Survival and integration of tissueengineered corneal stroma in a model of corneal ulcer. Cell Tissue Res 2007;329(2):249257
7 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies. Tissue Eng 2001;7:211228
8 Lanza R, Langer R, Vacanti J. Principles of tissue engineering. 3rd ed. Burlington, MA: Elsevier Academic Press 2007:10251047
9 Liu YX, Zhao M. Research advance of seed cell sources and planting technology in the ocular surface reconstruction by tissue engineering. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2008;8(2):351354
10 Ma Y, Xu Y, Xiao Z, et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrowderived human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006;24(2):315321
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