作者：杨柳，李岱，吴开力
作者单位：(100050)中国北京市，首都医科大学附属北京天坛医院眼科；(437100)中国湖北省咸宁市,湖北省咸宁学院；（510060）中国广东省广州市，中山大学中山眼科中心
【摘要】 目的：研究汉防己甲素(tetrandrine ,Tet )对人眼Tenon囊成纤维细胞(Tenon’s capsule fibroblasts，TCFs)的抑制效应。方法：用组织块和混合消化液培养法体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞，并对培养的传代细胞进行形态学的鉴定。采用MTT法检测不同浓度的汉防己甲素（104，105，106，107mol/L）及0.2g/L丝裂霉素（MMC）对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用。结果：人眼Tenon成纤维细胞体外生长良好，经光镜和免疫组化观察证明该细胞为成纤维细胞。MTT法证实，随着Tet药物浓度的增大，TCFs增生活性降低，对应的TCFs抑制率升高。结论：Tet对人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。
【关键词】 汉防己甲素 成纤维细胞 Tenon囊 MTT
0引言
中药汉防己甲素(tetrandrine,Tet)是防已科植物粉防已根或藤中的主要生物碱，为双苄基异喹衍生物。目前，Tet已广泛应用于治疗全身病，其中抗肺纤维化等作用，为进一步研究和应用其防治青光眼滤过手术区瘢痕形成提供了有益启示。为此，我们首次观察了Tet对人眼Tenon囊成纤维细胞(Tenon’s capsule fibroblasts，TCFs)体外增殖的抑制作用并探讨可能的作用机制，为下一步探讨其为抗青光眼滤过瘢痕药物提供体外实验依据。
1材料和方法
1.1材料 Tet（江西诺伊尔药业有限公司，纯度100%，精密称量适量粉剂，用极少量 HCl溶解，再用培养液稀释到所需浓度，调节pH值为7.0，过滤除菌备用）；注射用丝裂霉素C (mitomycin C，MMC,日本协和发酵工业株式会社产品，用培养液稀释到0.2g/L，过滤除菌备用)、RPMI 1640(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(Gibco)、噻唑兰[3(4，5dimethyl2thiazol)2，5diphenyl2Htetrazolium bromid，MTT] (Sigma)为黄色结晶，以磷酸盐缓冲液溶解，配成浓度为5g/L溶液，0.22μm滤膜过滤除菌、二甲基亚砜(DMSO)(广州化学试剂厂)。WateeJacketed二氧化碳培养箱(美国Forma Scientific)、超净工作台(上海明星电子设备厂)、高速离心机(Universal 32R德国)、倒置相差显微镜(Olympus BX 50美国)、塑料培养板、紫外分光光度计（Pharmacia）。人眼成纤维细胞来源于广州中山眼科中心角膜移植供体眼球结膜下Tenon囊组织。供体处理及混合细胞消化液培养同郑健梁，蓝育青等研究报道[1，2]。取第3～7代细胞进行实验。用倒置相差显微镜观察在细胞生长的不同时期细胞的生长特点及形态。将上述长有细胞的盖玻片用PBS液洗涤,并经甲醇和丙酮固定后，按免疫组化试剂盒说明书，作Vimentin 染色。
1.2方法 取对数生长期细胞，调整细胞密度为108/L，转移到96孔板内，37℃培养24h后，弃去原培养液，分A～F组，每组6孔。A组只加培养液200μL，B～F组每孔分别加入终浓度为104，105，106，107mol/L的Tet，0.2g/L MMC培养液200μL。37℃培养48h后弃去接种液，每孔加入浓度为5g/L的MTT溶液20μL，继续培养4h后，弃原有培养液，每孔加入DMSO 200μL，震荡15min，用Multiskan酶标仪双波长法测各孔在540nm和650nm处的光吸收值(A值)。通过各时间点A值变化反映细胞的增殖情况。细胞抑制率=空白对照组平均A值处理的平均A值/空白对照组平均A值×100%。
统计学分析：吸光度A值，取平均值±标准差(±s)表示，用单因素方差分析，对数据作统计学处理，以上统计均用SPSS 11.0软件处理。
2结果
2.1体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞特性 体外培养的人成纤维细胞，接种后约1～2d，细胞开始贴壁生长，繁殖较快，约2wk后细胞基本融合，呈放射状或旋涡状走行。光镜下检查呈典型的梭形和不规则三角形，胞体狭长（图1）。经免疫组化Vimentin染色，见阳性产物呈棕色反应，均匀分布于细胞的胞质中（图2）。Tet作用后不仅细胞数逐渐减少,细胞形态也发生了明显的变化,细胞相互间隙逐渐增大，形态、轮廓明显，细胞明显皱缩，变圆，药物浓度愈高，变化越明显(图3，4)。
2.2 Tet对 TCFs细胞增生的抑制作用 Tet在104～107mol/L的浓度范围内，随着药物浓度的增大，MTT比色值下降，与RPMI 1640组相比均有显著差异, 而对应TCFs生长的抑制率却上升，呈现出剂量效应关系，说明Tet在此范围内对TCFs的增殖有明显的抑制作用。而0.2g/L MMC组的A值与104,105mol/L Tet组相比无显著性差异，与其它组均有显著差异(P＜0.01)；对TCFs抑制率除104mol/L Tet组外，均高于其它组（表1）。
3讨论
青光眼滤过术后滤过泡瘢痕形成的机制目前尚不完全清楚，一般认为修复细胞，主要是成纤维细胞(fibroblast，Fb)大量增殖与凋亡抑制、细胞外基质中胶原合成与降解失衡、部分细胞因子的大量产生及三者密切关系构成了病理性瘢痕形成的生物学基础[3]。适宜的细胞外及细胞内Ca2+浓度对细胞的增殖是必需的，胞质中Ca2+浓度增加，被认为是细胞分裂和增殖的原始信号。细胞中G0期过渡到 G1期，G1期过渡到S期都依赖胞内Ca2+信号[4]，而Tet既是天然的非选择性钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白拮抗剂。Tet能明显降低成纤维细胞内Ca2+浓度[5]，说明Tet可能通过抑制钙离子通道降低细胞内钙离子浓度，抑制钙离子信号途径，从而使TCFs增殖受阻于G0～G1期。
MTT结果表明,Tet组A值明显低于对照组(P<0.01)，而对应的抑制率明显高于对照组,呈现剂量依赖关系，可进一步说明实验浓度的Tet可直接抑制成纤维细胞过度增殖这一环节。其作用机制可能是Tet能有效抑制细胞外Ca2+向细胞内流动和细胞内Ca2+储存池中Ca2+的释放，从而阻断了细胞因子刺激信号的传递，使依赖Ca2+参与的DNA和蛋白合成受阻。青光眼滤过术后滤过泡纤维增殖是导致手术失败的主要原因，因此寻找高效、无毒的抗纤维增殖剂是至关重要的。本研究为Tet用于抗纤维增殖提供了体外实验依据，为进一步探讨Tet成为抗青光眼滤过术后滤过泡瘢痕形成药物提供理论依据。
图1 正常TCFs胞体狭长呈梭形（×100）（略）
图2 Vimentin棕色阳性物均匀分布于细胞胞质中（略）
图3 10-5mol/L Tet作用24h后间隙增大变圆，部分脱落(×100)（略）
图4 10-4mol/L Tet作用24h后细胞间隙大，数目稀少 (×100)（略）
表1 Tet对TCFs抑制作用（略）
bP＜0.01 vs 0mol/L
【参考文献】
1郑健梁，郭彦，张洁，等.人眼Tenon氏囊成纤维细胞的体外培养.解剖学研究 1999；21(2):9697
2蓝育青，葛坚，林明楷，等.MTT法检测干扰素γ对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制效应.实用医学杂志 2002；18(2):123125
3 Chihara E, Dong J, Ochiai H, et al. Effects of tranilast on filtering blebs:a pilot study. J Glaucoma 2002;11(2):127133
4 Short AD, Bian J, Chosh TK, et al. Intracelluar Ca2+ pool content is linked to control of cell growth. Prol Natl Acad Sci USA 1993;90(11):49864990
5徐永红, 边城, 李定国，等.汉防己甲素对成纤维细胞游离Ca2+浓度影响的机制探讨.胃肠病学和肝病学杂志 2003;12（5）：422423 |
