结果

    一、RB患者及健康人外周血DC的培养与鉴定

    培养6-10d，见大部分细胞悬浮生长，呈圆形或类圆形，体积变大，并有较多的毛刺，呈现典型的DC形态，同时可见一些小淋巴细胞及紧密贴壁的巨噬细胞。取培养的DC电镜观察见DC胞膜伸展出大量长短不一突起，细胞核染色较深，形状不规则，多偏于一侧，胞质含有丰富的线粒体，吞饮泡较多，溶酶体较少，其体积明显大于淋巴细胞。用FITC标记的HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CDla、CDl4单克隆抗体对培养所获的健康人和RB患儿外周血诱导的DC细胞进行标记，并通过流式细胞仪进行分析。结果表明，>80％DC细胞有MHC-Ⅰ、Ⅱ分子、HLA-ABC、HLA-DR及共刺激分子CD80的高表达，>70％有成熟DC特异性标志CDla的高表达，而单核细胞特异性标志CDl4的表达均由分离出PBMC时的>95％下降至<10％。S-100蛋白抗体免疫组化染色可见，棕色阳性物质均匀分布于DC胞质中，细胞体积较大，呈不规则形，其表面大量树枝状突起。同种混合淋巴细胞反应结果显示，从健康人及RB患儿外周血分离诱导的DC均能刺激同种异体淋巴细胞强烈增殖，随着刺激细胞数目的增加，其促增殖作用增强。研究结果表明，从健康人及RB患者外周血可获得相当数量的DC，且体外培养获得的DC经鉴定在形态、表型及功能等方面均与体内成熟的DC具有相同特点[5]。

    二、效应细胞的细胞毒活性检测

    光镜下观察用含白细胞介素2培养液培养的T淋巴细胞，形态为圆形或椭圆形，与负载肿瘤抗原的DC共培养后，一些T淋巴细胞围绕DC呈环样分布。效应、靶细胞混合培养4h后，光镜下可见许多效应细胞呈簇状聚集在肿瘤细胞周围，RB细胞皱折，透亮度减低，少量细胞已裂解成细胞碎片。

    MTT法检测结果显示，对于SO-RB50与Raji细胞2种靶细胞，健康人组和RB患者组效应细胞的细胞毒作用均随效靶比的增加而增加；不同效靶比健康人组与RB患者组CTL对SO-RB50细胞的杀伤作用均强于相应效靶比的Raji细胞，提示RB肿瘤抗原负载的DC诱导出抗原特异性CTL；而不同效靶比健康人组与RB患者组CTL对Raji细胞的非特异性杀伤作用则相近，两者差异均无显著意义(P>0.05)。不同效靶比健康人组与RB患者组CTL对SO-RB50的特异性杀伤作用的差异均有非常显著意义(t值分别为11.75，12.38，11.98；P<0.01)，说明RB患者组CTL的活性较健康人组弱。

    讨论

    RB发病的遗传特性和较高的自发退变率一直是医学生物界关注的热点之一，尽管过去几十年RB分子生物学研究获得了较大进展，但有关RB患者特异性T细胞免疫反应的诱导和表达情况研究极少。RB具有高度的免疫原性，易玉珍[1]与Sang和Albert[9]发现RB瘤组织内及周围均可见到较多的淋巴细胞、单核细胞浸润；电镜下可见淋巴细胞进入肿瘤细胞及多核巨噬细胞吞噬变性的肿瘤细胞现象，提示RB退变与免疫反应的关系非常密切。T细胞介导的特异性细胞免疫反应可能在免疫反应过程中起了主要作用。研究表明，机体在抗肿瘤免疫过程中，肿瘤抗原只有被APC加工、处理、提呈后，T细胞才能被活化和增殖，产生有效的初次特异性免疫应答[10]。而树突状细胞作为人体内功能最强、惟一能激活初始型T细胞的APG，被认为是体内细胞免疫反应的启动者[5]。动物实验研究表明，负载了抗原的DC可产生保护性的免疫反应，杀伤肿瘤细胞，显著延长荷瘤动物的生存时间[11]。李永平等[12]曾利用淋巴因子激活的杀伤细胞直接对SO-RB50细胞进行体外杀伤，但未发现有特异性的CTL形成，可能是由于缺乏抗原呈递，无法杀伤肿瘤细胞所致。

    本研究成功地从RB患者外周血中诱导获得成熟的DC细胞，并以此为基础，将负载肿瘤抗原的DC疫苗活化自体T细胞，对肿瘤细胞进行体外杀伤。结果表明，采用RB细胞冻融蛋白抗原负载DC，与自体淋巴细胞体外共育后，健康人组与RB患者组均诱导出抗原特异性CTL，能特异性杀伤表达全部肿瘤抗原的SO-RB50瘤细胞，与Raji细胞组比较，不同比例的杀伤作用差异均有显著意义，提示诱导出了抗原特异性CTL。健康组与患者组对SO-RB50细胞特异性的杀伤作用差异均有显著意义，患者组CTL的活性较健康人组弱，原因可能是由于RB患儿免疫功能异常，抑制了DC的功能，使其抗原呈递能力降低，造成T细胞不能有效活化所致，后者有待于检测患者T细胞反应能力来进一步证实。而各效靶比健康人组与RB患者组CTL对Raji细胞的非特异性杀伤作用则相近，两者差异无意义显著意义，反过来进一步证实诱导出了针对SO-RB50抗原特异性的CTL。

    致敏DC的抗原有多种，本实验采用的是可溶性肿瘤细胞冻融蛋白抗原，其理由在于：(1)RB瘤细胞性的抗原易于获取和制备，成本低，有较大的临床应用潜力；(2)利用外源性的肿瘤细胞抗原致敏DC诱导产生保护性抗肿瘤免疫反应，已为众多实验所证实，有效性较高；(3)有研究表明，利用肿瘤细胞冻融蛋白抗原进行DC免疫治疗在儿童实体瘤中具有一定的安全性；(4)肿瘤细胞的冻融蛋白抗原作为总的肿瘤抗原包含了肿瘤细胞各种抗原的全部信息，针对多个抗原决定簇的CTL克隆共同作用可能发挥最佳的抗肿瘤效应[13]目前除了对黑色素瘤等少数抗原性强的肿瘤抗原有一些了解外，绝大多数肿瘤抗原的性质仍不清楚。利用视网膜母细胞瘤组织直接免疫鼠，制备抗人RB单克隆抗体，并对佃的相关抗原进行研究[14，15]，结果表明RB表达有特异性抗体识别的肿瘤抗原，但有关这种抗原的性质及RB患者血清中是否存在针对这些抗原的抗体还不清楚，因此RB特异性肿瘤抗原仍未找到。由此可见，利用RB混合抗原致敏DC可克服单一抗原决定簇的不足，从而诱导出有效针对多个RB抗原决定簇的CTL克隆。

    综上所述，本研究体外从RB患者和健康人外周血中诱导扩增出成熟DC，并进一步利用RB肿瘤细胞总的冻融蛋白抗原冲击致敏DC，激活自体T细胞，通过不同的效靶比体外对SO-RB50进行杀伤，结果表明，能够诱导出针对RB细胞系SO-RB50的抗原特异性CTL，提示有潜在的临床应用价值。同时，在本实验的过程中发现不同来源的DC诱导出的特异性CTL活性存在较大差异，但造成这种差异的具体原因目前还并不明确，需要进一步深入研究和探讨。

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