单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)在眼部感染主要为HSV-Ⅰ型，其最主要的生物学特性是能够形成潜伏感染，目前已公认HSV-Ⅰ可以潜伏在静止期单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)角膜组织中。针对正常角膜内是否有HSV-Ⅰ的存在，近几年国内外学者采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测到正常角膜内存有HSV-ⅠDNA[1-3]。本研究通过用3种方法检测HSV-Ⅰ，探讨其在正常角膜上皮细胞内存在的可能性。
一、材料与方法
1．材料来源：角膜上皮由西安市准分子激光屈光治疗中心提供。选取69例患者138只近视眼(既往无角膜病毒感染史，裂隙灯显微镜检查未见异常，视为正常角膜)行准分子激光屈光性角膜切削术(PRK)时所刮取的角膜上皮，每份上皮均匀分为3部分，两份分别涂于原位载玻片和普通载玻片上，丙酮固定≥30 min，第3份放人0.3 ml容量的小试管溶液中(含青霉素钠500 U／ml、链霉素500 U／ml的生理盐水)，低温冰箱保存。
2．检测方法：(1)间接免疫荧光法检测(IFA)，方法参见文献[4]。阳性对照：取自门诊初诊的5只眼上皮型HSK上皮涂片；阴性对照：磷酸缓冲液(PBS)替代第一抗体，再加羊抗鼠的荧光标记抗体进行检测。(2)原位PCR检测，方法参见文献[5]。阳性对照：临床确诊的上皮型HSK角膜上皮涂片；阴性对照：无引物的HSK活动期角膜切片。(3)病毒分离培养：取低温保存的标本41份(包括同源于原位PCR检测和IFA检测阳性的角膜上皮)室温溶解，培养方法参见文献[6]。(4)电镜样品制作和观察：将培养管内样品离心后置于2.5％的戊二醛固定液中，固定3 h，0.1 mol／L PBS浸洗，1％四氧化锇固定液固定2h，0.1 mol／LPBS浸洗，乙醇梯度脱水，还氧丙烷置换，还氧树脂Epon 812包埋，超薄切片机(瑞典LKB公司)进行厚度50-70mm超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染后，日本日立H400型透射式电子显微镜下观察。
二、结果
1．IFA检测结果：138只眼中4只眼阳性(2.9％)，3只眼可疑，131只眼阴性。阳性对照：临床确诊的5只眼上皮型HSK检测结果均为阳性。阴性对照：均未见荧光细胞。
2．原位PCR检测结果：138只眼中8只眼(5.8％)角膜上皮检出HSV-ⅠDNA，表现为部分细胞核或胞质呈鲜红色阳性信号，其中3只眼与IFA检测结果一致。阳性对照：6只眼上皮型HSK中5只眼有阳性信号。阴性对照：未发现阳性信号。
3．接种培养结果：2份标本首次接种出现可疑细胞病理学改变(cell pathology effect，CPE)；39份标本经2次实验未出现CPE，对其中9份(原位PCR和IFA检测阳性的同源角膜上皮)培养标本进行电镜扫描，未见病毒颗粒。
三、讨论
针对正常人角膜是否有HSV-ⅠDNA的存在甚至HSV-Ⅰ的潜伏，近年来国内外研究表明采用PCR能够从少部分正常角膜中扩增出HSV-ⅠTK基因[1，2]，甚至1999年Neufeld等[7]报道用病毒分离培养和PCR检测证实供体角膜中潜伏HSV-Ⅰ。
本研究通过用IFA检测138只近视眼角膜上皮HSV-Ⅰ抗原，4只眼出现阳性结果(2.9％)，提示可能有病毒颗粒的存在。为便于组织细胞定位，我们同时采用原位PCR检测，其特点是能够在细胞原位对目的基因进行扩增，用原位杂交技术进行定性和定位研究，因此敏感度和特异性均高。HSV-Ⅰ中与潜伏和活化密切相关的功能基因为LATs基因，其不同于其他基因序列，急性感染时在被感染细胞内含量很低，而在潜伏感染时含量增加，因此是目前惟一能检测出潜伏期转录的基因序列。本研究以LATs高保守、高特异基因序列(541-867碱基对)为扩增目标，检测结果提示8只眼角膜上皮内存有HSV-ⅠDNA，其中3只眼与IFA检测结果相吻合。实验结果提供了HSV-Ⅰ功能基因在正常角膜上皮内存在的依据。
为进一步证实正常角膜上皮内有无病毒颗粒，我们对41份角膜上皮进行病毒分离培养，未出现CPE，原因可能是病毒浓度低或体外的培养环境不具备病毒复制的适宜条件。1996年Morris等[1]，对80份供体角膜行PCR检测，HSV-I阳性率3.8％，但病毒分离培养无1例阳性，与本研究的结果相似，区别仅是其材料为全层角膜。
本研究表明部分HSV-Ⅰ可能是以不完整的基因组形式存在于正常角膜上皮细胞中，因为取材只限于角膜上皮，所以不能排除有完整的病毒基因组存留在全层角膜中。若欲证实其是具有复制功能的完整病毒，需做多个功能基因组的PCR检测，如TK基因和DNA聚合酶基因，同时，对病毒行体外活化培养后、再检测确定有无活性的HSV-Ⅰ存在于正常角膜中。 |
