[摘要]  目的  研究视网膜母细胞瘤(RB)抗原致敏的树突状细胞(DC)疫苗体外特异性对RB细胞系S0-RB50杀伤作用，为进一步研究RB的治疗提供新的思路。方法  以RB细胞的蛋白抗原体外冲击致敏健康人(正常对照组)及肋患者(患者组)来源的成熟DC，并将其与自体T细胞混合培养，诱导出抗SO-RB50的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，以Bmklu淋巴瘤Raji细胞作为对照靶细胞，采用噻唑蓝(MTT)分别比较CTL对SO-Raji细胞的杀伤率及正常对照组与RB患者组来源特异性杀伤率的组间差异性。结果  对SO-RB50与Raji2种靶细胞，正常对照组和郧患者组的CTL细胞毒作用均随着效靶比的增加而增加，对SO-RB50细胞的杀伤作用各效靶比均强于相应效靶比的Raji细胞(P<0.01)；各效靶比正常对照组CTL对SO-RB50细胞的特异性杀伤作用均显著强于RB患者组CTL(P<0.01)；而各效靶比正常对照组与阳患者组CTL对Raji细胞的非特异性杀伤作用则相近，两者比较，差异无显著意义(P>0.05)。结论  应用RB抗原负载DC可诱导出针对SO-RB50细胞抗原特异性的CTL，这种方法对RB的治疗可能具有潜在的临床应用价值。

    [关键词]  视网膜母细胞瘤；树突状细胞；T淋巴细胞，细胞毒性；免疫治疗，过继

    视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)为婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，不仅危害视功能且威胁患儿生命[1]，其发病率有上升趋势。近年来对RB的发生发展机制的研究有了很大进展，但在临床治疗中仍有不少问题和困难，如在清除或杀灭肿瘤细胞的同时，不可避免会损伤宿主体内免疫系统固有的抗肿瘤功能。随着肿瘤分子免疫学的飞速发展，以免疫治疗为主的生物治疗已成为肿瘤治疗的第4主要模式[2]。树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，也是惟一能激活初始型T细胞的APC，且可在缺乏其他任何刺激因子的条件下启动机体的免疫反应，因而在激活T细胞介导的细胞免疫中具有重要作用。另一方面，细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)应答在抗肿瘤免疫和抗病毒过程中占据主导地位[3]。用特异性肿瘤抗原负载DC，与自体T细胞共培养，可诱导出抗原特异性CTL，特异性杀伤表达肿瘤抗原的靶细胞。本研究首次尝试从健康人和RB患者外周血中诱导出成熟DC，以RB细胞冻融抗原体外冲击致敏DC，诱导出针对SO-RB50细胞系特异性的CTL，并测定杀伤活性的组间差异性，旨在为RB及其他眼内恶性肿瘤的免疫治疗开辟新的途径。

    材料和方法

    一、主要试剂和材料

    重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF)购自厦门特宝生物工程有限公司。重组人白介素4(recombinant human interleukin4，rhIL-4)购自英国Pepro Tech EC Ltd公司。重组人白介素2(recombinant human interleukin2，rhIL-2)购自加拿大真达公司。噻唑蓝(methyl thiazolyl letrazolium，MTT)购自上海生物工程有限公司，二甲基亚砜、牛血清白蛋白、2-巯基乙醇、考马斯亮蓝和台盼蓝购自美国Sigma公司。RPMI-1640培养基、新生胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和谷氨酰胺购自美国Gibco公司。淋巴细胞分离液购自上海恒信公司。健康人外周血来自广州血液中心健康志愿者，患者外周血来自中山大学中山眼科中心眼肿瘤科临床及病理确诊并排除其他全身疾病的RB患儿。人RB细胞株SO-RB50由中山大学中山眼科中心病理室建系提供[4]。Burkitt淋巴瘤Raji细胞株由中山大学肿瘤防治中心肿瘤研究所提供。

    二、实验方法

    1．DC的培养、诱导扩增[5,6]：(1)采血：采集正常志愿者及RB患者外周血5-8 ml，肝素抗凝，加入适量无钙镁D-Hank's缓冲液(pH值为7.4)，充分稀释混匀。(2)外周血DC的诱导扩增：淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)[7]。洗涤细胞3次。用含10％胎牛血清的RPMll640培养液调整细胞浓度为2×106个/ml，然后接种于24孔板，2×106个/孔。5％C02，37℃条件下孵育2h后，吸弃培养上清，用预热的培养基轻洗板1次，去除非黏附细胞，即获得贴壁的单核细胞，再加入含100 μg/L rhGM-CSF和10 μg/L rhlL-4的RPMll640完全培养基1.2ml进行培养，1次／2d，在培养箱中态学、细胞表型、免疫组化及免疫功能等检测。

    2．特异性细胞毒实验：(1)RB细胞蛋白抗原的制备：收集培养瓶中处于对数期生长的SO-RB50瘤细胞，用PBS缓冲液洗细胞2次，调细胞浓度为1×107个细胞/ml，将细胞悬液置于液氮罐5min，迅速取出放入37℃水浴中，如此反复3次冻融细胞，然后将冻融液在4℃下，12000r/min离心30min，取上清液经微孔滤膜过滤后作为肿瘤蛋白抗原，4℃保存备用。(2)靶细胞的制备：培养SO-RB50细胞与Raji细胞，每隔2-3d换液1次。收集对数期生长的2种肿瘤细胞分别以台盼蓝染色测定细胞活力，活细胞数必须>95％。调节其浓度为2×104个/ml，作为靶细胞备用。(3)RB抗原冲击致敏DC[8]：培养后6d，于DC中加入RB细胞蛋白抗原，每孔加入100 μl／孔。培养4d后收集负载了抗原的DC，PBS洗涤1次，再用培养基调DC浓度为1×105／ml备用。(4)效应细胞的制备：采集健康人及RB患者自体外周血，分离PBMC，洗涤细胞3次。用培养液调细胞浓度为2×106个／ml，然后接种于24孔板，每孔2×106个细胞。孵育2h后，取非黏附细胞，即淋巴细胞，用含10％胎牛血清、100μg/ml rhlL-2、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMll640培养液培养5 d，然后收集细胞，调细胞浓度为2×106个细胞/ml备用。将经RB抗原冲击致敏的DC与培养的自体淋巴细胞于含100 μg/ml rhlL-2、100μg/L rhGM-CSF、10 μg/L rhlL-4及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMll640完全培养基中继续培养5 d，收集细胞后调浓度为1×106个／ml即为效应细胞。(5)MTT法检测效应细胞的杀伤能力：将靶细胞浓度固定为2×104个／ml，效应细胞调浓度分别为1×105，2×105及4×105个／ml信使用96孔板，实验组每孔加入效应细胞和SO-RB50靶细胞悬液各100μl；对照组每孔加入效应细胞和Raji靶细胞悬液各100μl，每种条件设3个复孔，各组的每孔总体积均为200μl。使效应细胞与靶细胞的比例分别为5：1，10：l和20：l；同时设立效应细胞和2种肿瘤靶细胞的平行对照孔，均设3孔，每孔加入效应细胞或靶细胞悬液100 μl RPMll640培养液100μl，总体积为200μl，空白对照调零。将效应细胞和靶细胞共同孵育4h后，效靶混合孔及平行对照孔每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20μl，再孵育4h，小心吸弃上清，仅留少量残液，每孔加入150μl的二甲基亚砜，37℃下振摇溶解10min，用酶标仪检测各孔吸光度(A)值，波长为570 nm，然后计算杀伤率。杀伤率计算公式为：

    杀伤率：[靶细胞A值-(效靶细胞杀伤后A值细胞A值)]／靶细胞A值×100％

    三、统计学分析效应

    本研究计量资料用均数±标准差(X±s)表示。实验结果采用SPSSl0.0统计软件对两样本采用t检验，多样本均数的比较采用方差分析对数据进行分析。

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