【摘要】　目的　研究原发性视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）家系中缓慢型视网膜变性（retinal degeneration slow, RDS）患者的RDS基因突变与临床表型的关联，以探讨RP的发病机制。方法对来自同一家系的2例RP患者及2例正常人外周血DNA进行分子遗传学分析，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）及限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）技术，筛查RDS基因突变，对有突变的RDS基因片段进行克隆测序及分析，同时进行家系分析及眼部临床检查。 结果　来自同一家系的2例RP患者均查出有RDS基因216密码突变，而2例正常人未查出上述突变。经测序证实RDS基因216密码子的第2个核苷酸出现了C→T的突变（Pro216Leu）。RDS基因Pro216 Leu突变的眼部临床表型为视力损害严重的弥漫型RP，伴有黄斑部病变。结论　中国人RP患者存在RDS基因Pro216 Leu突变；其眼部表型为弥漫型RP伴有黄斑部病变。

　　The study of RDS gene mutation and clinical phenotype in a family with primary retinitis pigmentosa

　　YANG Hua, LUO Chengren, ZHOU Jiumo

　　（Department of Ophthalmology, First Clinical Medical School, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041，China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate retinal degeneration slow (RDS) gene mutation in a Chinese family with primary retinitis pigmentosa (RP) and the association of the mutation with clinical phenotypes and to explore the pathogenesis of RP. Methods　 Blood DNA from 2 patients in the same family with RP and 2 normal persons was analyzed by molecular genetic methods. RDS gene mutation was screened out by polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. The mutant RDS gene fragment was cloned, then sequenced with an automatic DNA sequencer using a dideoxy chain termination protocol. The phenotype of the patients with the gene mutation were examined and determined by clinical ophthalmologic examinations. Results　 The PCR-RFLP analysis of the RDS gene in 2 patients with RP revealed codon 216 mutation of RDS gene. The mutation was heterozygous, and not found in 2 normal persons as controls. The alteration in the DNA sequence was identified as a heterozygous transversional change of C to T at the second nucleotide in codon 216 of RDS gene, resulting in the amino acid replacement of proline residue with leucine residue (Pro216Leu). The ocular finding of the patients with Pro216Leu mutation of RDS gene included severe visual loss and diffuse distribution of pigmentary changes with macular degeneration. Conclusions　 The Pro216Leu mutation of RDS gene is found in Chinese patients with RP. The gene mutation is associated with the ocular phenotype, diffuse RP with macular degeneration.

　　【Key words】　Retinitis pigmentosa； Gene； Phenotype； Polymerase chain reaction

　　在遗传性视觉损害中，原发性视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是致盲的最常见原因之一。在发展中国家，以往最常见的致盲性眼病如维生素A缺乏或感染所致的角膜瘢痕、白内障等的发病率现正在逐年降低，而包括RP在内的遗传性疾病则逐渐成为致盲的主要原因［1］。研究表明缓慢型视网膜变性（retinal degeneration slow, RDS）基因又称盘膜边缘蛋白基因，其与RP发病相关，本研究对来自同一家系的中国人RP患者进行RDS基因突变的筛查，并对有基因突变的中国人RP患者的眼部表型进行分析，为从DNA水平研究RP的发病机制和进一步对RP进行合理分类提供理论基础。

　　对象与方法

　　1. 研究对象：选择同一家系的2例RP患者（先证者及先证者之父）及经眼部检查无RP等其他眼部疾患的2例正常人（先证者的弟弟和长子）。先证者及先证者之父均于20岁或20岁前出现夜盲和视力下降症状，分别于1988年、1964年经眼底、视觉电生理、视野、眼底血管荧光造影及眼部常规检查确诊为RP（表1）。家族中先证者的姑姑和祖母有类似病史且已故。RP诊断标准：(1)有夜盲史；(2)眼底检查可见骨细胞样或不规则的色素沉着，视网膜血管缩窄和视盘颜色蜡黄或变淡；(3)全视野视网膜电图显示异常或无波形；（4）视野缩窄或有环形暗点等特征性改变和（或）适应曲线阈值升高或视网膜杆体相缺如。

　　2. RDS基因突变的研究方法：收集新鲜周围静脉血5ml, 以苯酚/氯仿法抽提DNA［2］。聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）：采用美国Perkin Elmer 公司生产的480型DNA Thermal Cycler 仪。PCR试剂盒系德国Boeringer Mannheim公司产品。引物［3,4］：primer 1、2（primer 1: 5′-AAGCCCATCTC-CAGCTGTCTG-3′覆盖RDS基因内含子1的3′末端，primer 2: 5′-CTTACCCTCTACCCCCAGCTG-3′覆盖RDS基因内含子2的5′末端）由中国科学院微生物研究所合成。PCR反应系统：10×Buffer 10 μl, 50 mol/L MgCl2 3　μl，2.5　mol/L dNTP 8　μl，primer 1、2各2.5　μl(10　pmol/μl), DNA模板3.5　μl(30　ng/μl)，Taq DNA聚合酶0.5 μl(5 U/μl)，加ddH2O至100 μl。扩增条件：95℃ 5 min后加Taq DNA聚合酶，液体石蜡15 μl；变性94℃ 1　min，退火50℃ 2 min，延伸72℃ 3 min，共35个循环，再做72 ℃延伸6 min。PCR产物检测：扩增完毕，从100 μl PCR样品中取5μl样品在1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳（3 V/cm）检测，DNA分子量标记为华美生物工程公司的pGEM-3 Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Marker(587 bp、458 bp、434 bp、323 bp、314 bp、289 bp、267 bp、174 bp、142 bp、102 bp、80 bp、18 bp、11 bp)。0.5 μg/ml溴乙啶染色15 min后，用透射式紫外线观察，摄像。

　　限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析：限制性内切酶DdeⅠ系美国Promega公司产品。反应系统：10×Buffer 3 μl, Dde Ⅰ 0.5 μl(6U)，PCR产物14 μl，加ddH2O至30 μl。反应条件：37 ℃水浴1～2 h。取限制性内切酶消化后的样品15 μl在1.5 %琼脂糖凝胶上电泳(3 V/cm)，DNA分子量标记为pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ DNA Markers (657 bp、458 bp、434 bp、328 bp、289 bp、267 bp、174 bp、142 bp、102 bp、80 bp、40 bp、18 bp、11 bp)。0.5 μg/ml溴乙啶染色15 min后，用透射式紫外线观察并摄像。

　　将上述PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳并回收，加EcoR I adaptors接头及已连接接头的DNA末端磷酸化，去除未连接接头；制备克隆载体pUC18 DNA,用 EcoR I酶切并脱磷酸化，连接：pUC 18 DNA 2 μl，突变DNA 5 μl, 加ddH2O至7.5 μl，45℃ 5 min, 冷却至0℃，加入10×T4 DNA 连接酶Buffer 1μl, T4 DNA接连酶0.l Weiss 单位，5 mmol/L ATP 1 μl, 16℃温育4h。制备感受态细胞，转化质粒DNA，筛重组子，提取质粒DNA，筛选及鉴定阳性克隆［2］,经中国科学院微生物研究所基因工程中心测序。

　　3.眼部表型的检测方法：询问RDS基因突变患者的详细病史。绘制家系图，测视力、矫正视力，检查外眼，用裂隙灯显微镜检查眼前节，直接检眼镜检查玻璃体及眼底，进行闪光视网膜电图（flash electroretinogram, F-ERG）、Topcon 静态视野、Goldmann动态视野、眼底血管荧光造影（fundus fluorescein angiography, FFA）、眼底摄像、D-15色相配列试验及暗适应等眼部检查。

　　结果

　　1.RDS基因216密码子突变研究结果：本研究设计的引物primer 1位于人RDS基因内含子1的3′末端，引物primer 2则在内含子2的5′末端，用此对引物做PCR,扩增出RP患者和正常人RDS基因外显子2的DNA片段313 bp（图1）。正常人和无RDS基因216密码第887位点C→T颠换的RP患者，缺乏限制性内切酶DdeⅠ的酶切位点（DdeⅠ的识别序列为5′-C↓TNAG），其酶切产物长度仍为313 bp；如果出现杂合型基因第887位点C→T突变，则其酶切产物长度有3种，即313、215、98 bp(图2)。RDS基因外显子2的第216密码887位点C→T颠换，使216密码编码的脯氨酸(proline, Pro)突变为亮氨酸（leucine, Leu），即发生Pro216 Leu突变。经筛查来自同一家系的2例RP患者（先证者、先证者之父）有杂合型RDS基因Pro216Leu突变，而家系中的正常人则无此突变。经中国科学院微生物研究所基因工程中心测序证实为RDS基因单链Pro216 Leu（CCT→CTT）突变。

　　2. RDS基因Pro216 Leu突变与眼部表型的关联:详见表1及图3，4。

　　表1　有RDS基因Pro 216 Leu突变的RP患者眼部表型分析

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