作者：武静    作者单位：复旦大学附属金山医院 眼科，上海 200540

    【摘要】  目的 探讨提前光刺激对小鼠神经节细胞发育不同阶段感光视蛋白melanopsin表达的影响。方法 对出生4 d C57BL/6J小鼠右眼建立提前开睑接受光刺激模型，左眼作为自身对照，应用免疫荧光、RT-PCR和Western blotting方法比较小鼠5天龄、6天龄、7天龄、14天龄和90天龄时提前开睑组和对照组视网膜感光视蛋白melanopsin的分布及转录和翻译水平的表达变化。结果 Melanopsin阳性细胞在5天龄时就已经在视网膜上明显表达，随着小鼠视网膜发育的逐渐成熟，提前开睑组和对照组melanopsin表达均逐步下降；组内比较，在6天龄、7天龄、14天龄时melanopsin提前开睑组表达量均少于各自对照组，差异具有显著性（P<0.05）；90天龄时melanopsin表达最少，且提前开睑组和对照组差异无显著性（P>0.05）。结论 小鼠14天龄之前是melanopsin阳性神经节细胞发育的关键阶段，在此阶段内，melanopain阳性神经节细胞数量逐渐减少，提前开睑光刺激使melanopsin阳性神经节细胞数量进一步减少。本研究结果有助于揭示melanopsin在视网膜神经节细胞发育过程中的表达变化及其可能的分子机制。

    【关键词】  神经节细胞 感受作用 育 melanopsin

    Melanopsin是近十年来发现的一种视网膜神经节细胞表达的感光视蛋白。随着人们对视蛋白melanopain的逐步认识，突破了以往认为只有视锥和视杆细胞是哺乳动物光感受细胞的局限性，melanopsin阳性的神经节细胞也成为了哺乳动物继视锥和视杆细胞之外的第三种光感受性细胞[1-2]。进一步研究发现，与视锥和视杆细胞引起视觉成像（image-forming）功能不同，melanopsin阳性的神经节细胞的功能是参与非视觉成像(nonimage-forming)系统，包括调控生物节律、瞳孔对光反应、机体屏蔽效应等功能[3]。以往的研究大多集中在对成熟光感受性神经节细胞功能的探讨以及非视觉成像系统与视觉成像系统二者的联系和区别上。已知从小鼠出生到其14天龄左右自然开睑之前，小鼠视网膜仍处于发育阶段。本实验采用C57BL/6J小鼠建立提前开睑接受光刺激模型，研究小鼠视网膜神经节细胞发育过程中光刺激对melanopsin mRNA和蛋白水平的影响，探讨其可能的机制以及在视觉发育中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物及模型的制备  清洁级C57BL/6J小鼠，将鼠龄为4 d的新生小鼠右眼睑消毒后用手术刀片沿睑裂轻轻划开，暴露眼球，操作过程中勿伤及角膜，为防止睑裂黏连，每日早、中、晚3次用无菌湿棉签轻轻将眼睑分泌物擦去；左眼不做处理作为对照。将小鼠放在12 h光照、12 h黑暗环境中循环 饲养。取材时间鼠龄分别为5 d、6 d、7 d、14 d、 90 d，所有取材均在上午8时进行。

    1.2  实验方法

    1.2.1  固定取材及切片制备  小鼠经乙醚深麻醉后开胸，左心室快速灌注生理盐水约80 ml冲洗血液，随后用4%的多聚甲醛300 ml灌注固定。灌注结束后立即摘出眼球，去掉角膜后置于4%的多聚甲醛中过夜。次日用PB液洗掉多聚甲醛，每次5 min，重复3次，转入15%的蔗糖缓冲液，4℃脱水1 h，再用30%的蔗糖缓冲液脱水，4℃过夜。第3天，将眼球用滤纸吸干，OCT包埋剂包埋，液氮内迅速制冷，冰冻切片机内切片，切片厚10～16 ?滋ｍ。

    1.2.2  免疫组织化学染色  室温下将切片晾干，PBS冲洗，0.3% TritonX-100室温下处理10 min，10%山羊血清于37℃封闭30 min，抗melanopsin （1：50）的一抗孵育视网膜于4℃过夜，PBS充分冲洗后，荧光二抗（1：200）37℃孵育1 h，磷酸甘油封片。

    1.2.3  提取视网膜RNA和RT-PCR检测  小鼠经乙醚麻醉后脱颈处死，迅速取出眼球，用眼科显微手术器械轻轻取出视网膜，用细胞裂解液TRlzol提取RNA，按Takara试剂盒操作步骤逆转录RNA为cDNA。引物序列根据VectorNTI6.0软件设计，各基因的检测引物序列和扩增片段大小为：melanopsin上游序列5′ ATCTGGTGATCACAC 3′，下游序列  5′ TAGTCCCAGGAGCAG 3′，片段大小150 bp；内参照β-actin上游序列5′ CTGTGGCATCCACGAAACTAC 3′，下游序列5′ CGGACTCGTCATACTCCTGCT  3′，片段大小284 bp。逆转录反应条件：30℃ 10 min，50℃ 30 min，99℃5 min，5℃     5 min，1个循环。Melanopsin的PCR反应条件为：95℃ 8 min，1个循环，95℃ 15 s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，40个循环。内参照β-actin的PCR反应条件为：94℃ 2 min，1个循环，95℃ 15 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环。各取5 μl RT-PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察、摄片，对条带进行吸光光度值分析。以目的基因melanopsin  与内参照β-actin的平均吸光度的比值表示melanopsin的mRNA水平，进行半定量分析。

    1.2.4  提取视网膜蛋白及western blotting检测  ?譹?訛提取蛋白：小鼠处死后迅速取出眼球，用眼科显微手术器械轻轻取出视网膜，加入组织裂解液（50 μl裂解液/1个视网膜）立即匀浆，冰上静置30 min充分裂解，裂解产物12000×g 4℃离心30 min。取上清液置于清洁EP管中，在100℃沸水中煮5 min使之变性。?譺?訛SDS-PAGE电泳：配制10%分离胶和5%浓缩胶，每孔加样20 μl，电压100 V，电泳约2 h。?譻?訛转膜：恒流350 mA，转膜2 h。?譼?訛抗原抗体反应及ECL发光底物显影。一抗为抗melanopsin抗体（1：500），二抗浓度1：1000。β-actin作为内参，检测蛋白表达量的差异。本部分实验重复3次。

    1.3  统计学方法  实验数据以（x±s）表示，SPSS11.5统计软件包对组间数据行多样本均数q检验，组内数据采用成组设计资料的t检验。

    2  结果

    2.1  Melanopsin阳性细胞免疫荧光染色结果  小鼠5天龄时神经节细胞层已经形成，在形态上接近成熟小鼠，melanopsin阳性细胞在5天龄时就已经在视网膜上表达，由胞体和树突两部分组成，其胞体主要位于视网膜的神经节细胞层，轴突可以延伸到内核层，在视网膜外层无melanopsin阳性细胞的表达。小鼠提前开睑后melanopsin阳性细胞数量呈减少趋势，90天时表达最少。

    2.2  RT-PCR方法检测melanopsin mRNA的表达

    RT-PCR对特定的引物扩增后，可得到melanopsin在5天龄、6天龄、7天龄、14天龄和90天龄的提前开睑组和对照组以及β-actin的扩增产物图(见图1)。对其进行图像分析，分别计算melanopsin与   β-actin的条带吸光度值的比值。Melanopsin mRNA表达量在5天龄时最多，之后提前开睑组和对照组melanopsin表达均逐步下降；组内比较，在6天龄、7天龄、14天龄时提前开睑组mRNA表达量均少于各自对照组（P<0.05）；90天龄时melanopsin表达最少，且提前开睑组和对照组mRNA含量差异无显著性（P>0.05）（见表1）。

    2.3  Western blotting检测melanopsin蛋白的表达

    Melanopsin与β-actin蛋白的分子量分别为65 kDa和45 kDa，以β-actin的吸光度值作为内参照，对各组条带的吸光度值进行校正，进行半定量分析。在5天龄至14天龄期间，随着时间的延长两组melanopsin蛋白表达量均呈下降趋势，相同时间点提前开睑组melanopsin蛋白表达量较对照组降低（P<0.05）；90天龄时melanopsin表达最少，且此时提前开睑组和对照组蛋白含量差异无显著性（P>0.05）（见表2、图2）。

    3  讨论　　

     C57BL/6J小鼠在出生后14 d左右眼睑自然睁开，既往研究表明，小鼠在出生后2周左右内，视网膜仍然存在显著、有序的发育和分化过程[4-5]。本实验在成功建立新生C57BL/6J小鼠提前开睑模型的基础上，研究在视网膜发育逐步成熟的过程中melanopsin在mRNA和蛋白水平含量的变化，以及提前光照对melanopsin表达的影响。免疫荧光的结果提示，melanopsin阳性神经节细胞（光敏感性神经节细胞）在5天龄时表达最多，之后表达减少，在90天龄时melanopsin阳性神经节细胞表达最少。由于melanopsin阳性细胞占神经节细胞数量的比例很少（在成年C57BL/6J小鼠约1%的神经节细胞表达melanopsin[6]），免疫荧光方法也无法准确量化阳性细胞的表达量，据此我们为了验证以上结果和更进一步地证实提前光照组和对照组melanopsin表达的差异，运用RT-PCR和western blotting法由mRNA和蛋白水平检测melanopsin的表达状况。两者结果都提示，在视网膜神经节细胞发育过程中，提前开睑组和对照组melanopsin含量均逐步下降，在5天龄到14天龄过程中下降趋势明显，在14天龄到90天龄过程中下降趋势趋于平缓；组内比较，14天龄之前提前光照组melanopsin的表达低于相应对照组。以上证据表明，小鼠从出生到14天龄之前阶段是视网膜光敏感性神经节细胞发育的关键时期，在这一时期内melanopsin表达逐渐减少，14天龄之后melanopsin表达基本稳定。目前这一生理变化发生的机制还不清楚，但光刺激可以下调melanopsin的表达。　　

    既往研究表明，在光刺激传导过程中，melanopsin阳性神经节细胞主要功能是感受和传递光信号，melanopsin接收光照强度变化的刺激，引起其分子构象发生变化，光敏感性神经节细胞因此兴奋，产生慢速去极化的动作电位并释放谷氨酸、垂体腺苷酸环化酶活性肽（PACAP）等递质，并通过视网膜下丘脑束（RHT）传导通路，将视网膜的光信号投射到大脑的视交叉上核等部位发挥相应的功能[7]。因此在视网膜发育过程中，melanopsin的含量逐渐减少可能为机体对光刺激的一种适应性的调节，可能是melanopsin与其受体结合后影响一系列生长因子和生物活性物质的代谢过程，最终导致melanopsin的mRNA、蛋白和活性水平的改变。其中多巴胺（dopamine）可能是重要的转录因子，参与melanopsin基因转录和翻译的调控。已知dopamine在视网膜发育、细胞凋亡、明适应等方面具有重要作用[8]。Vugler等[9]研究发现一定量的dopamine维持melanopsin的表达，光刺激使dopamine表达减少，从而减少melanopsin的表达。设想可以通过阻断dipamine受体途径等进一步实验研究证实melanopain的表达是否受到影响并探索其内在机制。

    以上现象的发现具有一定的临床意义，哺乳动物在胚胎期就有melanopsin的表达，光敏感性神经节细胞在出生时就已有感受光刺激的功能[10-11]，而视杆和视锥细胞在出生后10 d左右才有此功能[12]，因此在视觉成像系统还不具备功能的时候，melanopsin阳性神经节细胞就已经发挥非视觉成像作用了，提示我们新生儿过早过多地暴露在强光下可能对视网膜发育、眼和脑的正常生理功能带来损害。另外研究还发现一个有趣的现象，一些盲人虽然视杆和视锥细胞都已经完全退化，但melanopain阳性神经节细胞却基本没有受到影响，这些细胞依然可以感受光照强度的变化，具有调节生物钟的功能[13]，这一现象提示我们不能单纯为了美观的需要将盲人的眼球摘除。Melanopain在视觉发育过程中具有重要作用，期望本实验能为melanopsin光感受功能机制的进一步深入研究提供参考。

    【参考文献】

    [1] Lucas RJ， Freedman MS， Soni B， et al. Regulation of mammalian circadian behavior by non-rod， non-cone ocular photoreceptors[J]. Science，1999，284(5413)：502-504.

    [2] Lucas RJ， Douglas RH， Foster RG， et al. Characterization of an ocular photopigment capable of driving papillary constriction in mice[J]. Nat Neurosci，2001，4(6)：621-626.

    [3] Hattar S， Liao HW， Takao M， et al. Melanopsin-containing retinal ganglion cells：architecture， projections， and intrinsic photosensitivity[J]. Science，2002，295(5557)：1065-1070.

    [4] Braekevelt CR， Hollenberg MJ. The development of retina of the albino mice[J]. Am J Anat，1978，127(3)：281-302.

    [5] Young RW. Cell death during differentiation of the retina in the mouce[J]. J Comp Neurol，1984，229(3)：362-373.

    [6] Provencio I， Rollag MD， Castrucci AM. Photoreceptive net in the mammalian retina. This mesh of cells may explain how some blind mice can still tell day from night[J]. Nature，2002，415（6871）：4493.

    [7] Hannibal J， Georg B， Fahrenkrug J， et al. Melanopsin changes in neonatal albino rat independent of rods and cones[J]. Neuroreport，2007，8(1)：81-85.

   [8] Djamgoz MB， Hankins MW， Hirano J， et al. Neurobiology of retinal dopamine in relation to degenerative states of the tissue[J]. Vis Res，1997，37（24）：3509-3529.