作者：黄渝侃，张明昌，范可顺，张光红    作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022

    【摘要】  目的 观察压力对体外培养的牛角膜内皮细胞形态结构及细胞活力的影响。方法 对体外培养的牛眼角膜内皮细胞施以2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa的压力各6、12、24、36、48 h，以不加压组作为对照组。用倒置相差显微镜及电镜观察细胞形态结构，以台盼蓝染色观察比较48 h时各组细胞活力的差别，用单因素方差分析比较不同压力下阳性细胞率。结果 当作用于细胞的压力为2.67 kPa (1 kPa=7.5 mmHg)，作用时间为6、12、24、36、48 h时，与对照组比较，细胞形态结构均无明显变化；48 h时台盼蓝计数与对照组比较差异无统计学意义(P＝0.776)。当压力为5.33 kPa，作用时间为24 h时，细胞形态结构出现轻度的损伤，在36、48 h时加重；48 h时台盼蓝计数与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.00）。当压力为8.00 kPa时，6 h时即出现明显细胞形态结构损害，随着压力和作用时间的进一步增加，细胞的损伤程度也进一步加重；48 h时台盼蓝计数与对照组比较差异有统计学意义(P＝0.000)。结论 牛角膜内皮细胞在加压48 h时只能承受2.67 kPa的压力，当压力为5.33 kPa及8.00 kPa，施压48 h时，将造成细胞损伤及细胞活力下降。

    【关键词】  压力；角膜内皮细胞；角膜水肿

    角膜内皮细胞是位于角膜最内层的单层细胞，其完整性以及一定的细胞密度对于保持角膜脱水状态，并维持正常角膜厚度与透明性至关重要。当急性闭角型青光眼急性大发作,或其他原因导致眼压骤然升高时，角膜常失去脱水状态，从而导致角膜水肿、混浊。目前虽已证实高眼压所导致的角膜水肿是角膜内皮细胞受损引起，但压力对角膜内皮细胞本身的影响尚未完全明了。本研究通过构建压力模型，研究不同程度压力对牛角膜内皮细胞（bovine corneal endothelial cells，bCEC）的影响。

    1  材料和方法

    1.1  材料及试剂  胰蛋白酶（美国，Sigma公司），EDTA（武汉，凌飞科技有限公司），胎牛血清、DMEM （美国，Gibco公司），青霉素、链霉素、台盼蓝（上海，碧云天生物技术有限公司）。

    1.2  牛角膜内皮细胞培养  新生小牛来自武汉市吴家山奶牛场，于宰杀后立即将牛眼取出，用无菌的1：5000 HgOH溶液及生理盐水冲洗后，于2 h内用冰瓶运回进行组织培养。角膜内皮细胞的培养采用Li等[1]的方法。无菌状态下将角膜内皮向上放在一个浅的半球状固定容器内，用无钙的PBS液清洗。在角膜内皮上加入1 ml含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液，在培养箱内放置5～10 min。然后用塑料小杆轻轻刮擦角膜内皮，将分散的细胞用吸管转入含有10%胎牛血清和100 U/ml的青霉素和100 ng/ml链霉素的DMEM的25 cm2的培养瓶中，在5% CO2、37℃、95％湿度的培养箱中培养，每隔2～3 d 换培养基。在5～7 d细胞融合后进行传代，将传至第3代的细胞用于实验研究。

    1.3  细胞加压模型的建立及分组　　第3代牛眼角膜内皮细胞铺满瓶底及瓶内预置的盖玻片后，按张文强等[2]的细胞加压方法建立细胞加压模型，设加压压力分别为2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa (1 kPa=7.5 mmHg)各组为实验组， 未加压组为对照组，于37℃恒温培养箱中培养，每组细胞重复6瓶。分别于细胞加压6、12、24、36、48 h时取出部分盖玻片并收集细胞，做光镜和透射电镜观察。

    1.4  细胞形态和结构观察  取出各组瓶内预置的盖玻片，切片予常规脱蜡，水化，封闭，用PBS冲洗3次，瑞氏-吉姆萨染液染色30～60 s，PBS冲洗2～3次，苏木素复染，干燥后用中性树胶封片，用倒置相差显微镜观察细胞形态。另一部分行电镜切片，用PBS液冲洗2遍，在2.5%戊二醛液中固定30 min，以1%四氧化锇固定30 min，梯度酒精脱水，以Epon812环氧树脂做单层细胞包埋，用钻石刀做超薄切片，染色后经Hi-tachi Hu-11A透射电镜观察。

    1.5  细胞活力观察　　将各组细胞于48 h时用0.25%胰蛋白酶消化，收集后做台盼蓝染色。在血细胞计数板下，计算染成蓝色的死细胞及未染色的活细胞。计算细胞死亡百分率，取平均值。

    1.6  统计学方法  采用SPSS 11.5 软件包，对数据采用单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  压力对bCEC细胞形态的影响  对照组牛角膜内皮细胞呈不规则形状，有多边形、梭形、类圆形等，均有一大而清晰的核，细胞基本融合，密度较大(见图1)。2.67 kPa组细胞在48 h内未发生形态变化，与对照组无明显差异。5.33 kPa组细胞在6、12 h时均未见明显改变，24 h时细胞立体感降低，36 h时胞浆内出现少量空泡，48 h时空泡增多，少数细胞皱缩，核浓缩。8.00 kPa组细胞在6 h时胞浆即出现空泡，12 h时空泡明显增多，细胞形态改变，呈扁平状，部分细胞内出现皱缩，核膜、核仁欠清楚，核膜破裂，核内染色质浓缩，细胞密度降低(见图2)，48 h时大量细胞变圆、脱壁浮起。

    2.2  压力对bCEC细胞超微结构的影响  对照组bCEC细胞膜边界清楚，形态规则，线粒体及粗面内质网丰富，细胞核膜完整，常染色质丰富（见图3）。2.67 kPa组细胞超微结构未见明显改变。5.33 kPa组24 h内未见明显改变，48 h时部分线粒体肿胀，嵴肿胀，排列紊乱，基质疏松，粗面内质网扩张明显，并见大小不等的空泡(见图4)。8.00 kPa组较前两组压力继续增高，细胞质内线粒体肿胀，嵴消失，空泡样变，粗面内质网呈空泡样扩张，细胞核内染色质粗细不均，出现核膜不连续、核固缩等损伤(见图5)。

    2.3  压力对bCEC细胞活力的影响  根据台盼蓝染色计算各组细胞死亡率（见表1）。经单因素方差分析，各组间数值差异有统计学意义（F=415.48，P=0.000）。2.67 kPa组与对照组比较，差异无统计学意义（P＝0.776），5.33 kPa组及8.00 kPa组与对照组比较差异均有统计学意义（P＝0.000）。三个压力组间比较，差异均有统计学意义（P＝0.000）。　　

    3  讨论

    角膜内皮细胞受到损伤后通过两种方式代偿功能：一是周边细胞的扩大和移行，二是细胞分裂增殖。目前对于人的角膜内皮细胞（human corneal endothelial cells，hCEC）有无增殖能力尚无定论，虽然在体外表现出潜在增殖能力，但在成人眼中尚未发现hCEC增殖[3]。年龄、内眼手术、外伤、眼内炎症、角膜内皮细胞的自发性变性和坏死等因素均可引起角膜内皮细胞数量减少，如低于生理临界值则将导致角膜水肿和混浊,因此,对于角膜内皮细胞的保护至关重要。

    迅速增高的眼压能导致角膜内皮细胞损害，使细胞密度急剧降低。孙蔚等[4]发现急性闭角型青光眼急性发作致角膜内皮细胞降低7.3%~33%,而慢性闭角型青光眼患眼仅下降1.7%,说明角膜内皮对逐渐升高的眼压有一定耐受能力，而迅速增高的眼压可使角膜内皮受损。

    既往认为，高眼压造成角膜损伤的主要机制为以下两方面：其一为高眼压使支配角膜的感觉神经三叉神经眼支受压迫及角膜缘血管网灌注量下降，引起角膜营养障碍及角膜低氧，使内皮细胞获得的能量减少，并引起房水动力学改变，造成细胞结构受损；其二为角膜内皮泵上的Na+-K+-ATP酶受到高眼压影响，导致离子主动转运障碍，造成角膜水肿及内皮细胞损害[5]。但细胞组织对于压力本身的承受能力是有限的，如机械压力对于眼内其他组织细胞如小梁细胞和视网膜细胞等均可以造成机械性损伤[2，6]，因此，除了以上因素外，压力对于角膜内皮细胞本身直接造成的机械损害也可能是角膜内皮失代偿的原因之一。本压力模型在保持其他培养条件相同的前提下对细胞施加不同程度的压力，所选择的压力2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa分别对应人正常眼压上限、中度升高的眼压及极度升高的眼压，以此观察压力本身对于细胞的影响程度。

    本研究发现，眼压保持在2.67 kPa的状况时，bCEC形态结构未见明显改变，说明bCEC在一定时间内对于一定程度的压力具有承受能力。随着压力的逐渐升高，细胞在形态和超微结构上出现改变。此种改变表现为在超过细胞承受能力的同等压力状况下，细胞受压时间越长则细胞形态及超微结构改变越明显，在同等受压时间下细胞所受压力越高则细胞形态及超微结构改变越大。这说明在超过细胞所能承受的压力范围的状况下，过高的压力和过长的受压时间均会对细胞造成损害。从台盼蓝染色计数及统计分析结果可以看出，压力为2.67 kPa时，细胞活性与对照组比较变化不大，说明在可以耐受的压力状况下，压力对细胞活性影响不大。而当压力提高到5.33 kPa时，细胞着色明显增多，与对照组比较有显著差异，说明超出细胞承受能力的压力会导致细胞活力下降，不仅对细胞形态及超微结构造成影响，而且会导致死亡细胞明显增多。随着压力进一步增高，细胞活力进一步下降，大量细胞死亡，而残存的细胞在形态上和超微结构上也同时反映出严重的不健康状况。因此可以认为，压力本身可以对bCEC造成严重影响的，此种影响和以上提到的两种主要影响机制同时存在。故对于高眼压患者的眼压进行及时有效的控制是非常重要的，它不仅是为了保护视神经组织，同样也保护了眼内其他重要组织，其中也包括角膜内皮细胞。

    本研究发现，压力越高，作用于角膜内皮细胞时间越长，则细胞形态结构损害越严重。而细胞结构的损害与既往发现的角膜内皮细胞神经营养机制异常和角膜内皮泵上的Na+-K+-ATP酶破坏之间有何关联尚待进一步研究。对压力下损害的细胞结构和功能的研究也有望进一步揭示高眼压下角膜内皮细胞损害的发生机制。

    【参考文献】

    [1] Li J， Sun XC， Bonanno JA. Role of NBC1 in apical and basolateral HCO3- permeabilities and transendothelial HCO3- fluxes in bovine corneal endothelium[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2005，288(3)：739-746.

   [2] 张文强，杨新光，郭斌，等. 压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响[J]. 第四军医大学学报，2003，24(9)：802-804.

    [3] Joyce NC， Zhu CC. Human corneal endothelial cell proliferation： potential for use in regenerative medicine[J]. Cornea， 2004，23(8 Suppl)：S8-S19.

    [4] 孙蔚，蔡鸿英，孟宪锐，等. 急性眼压升高与角膜内皮细胞关系的探讨[J]. 中国实用眼科杂志，1999，17(8)：503-505.

    [5] 王继红，马力. 青光眼患者持续高眼压及眼压恢复正常后角膜内皮细胞损伤及修复的研究现状[J]. 包头医学院学报，2002，18(4)：376-379.

    [6] 李树宁，王竫华，王大博，等. 压力对体外培养大鼠视网膜Müller细胞的影响[J]. 中华眼科杂志，2005，41(4)：325-329.