山东 青岛 266003；2.青岛市立医院 外科，山东 青岛 266003

　　【摘要】  目的 研究神经生长因子（nerve growth factor, NGF）对兔眼急性高眼压视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）损伤的保护作用。方法 健康成年新西兰大耳白兔30只，随机分为5组，每组6只，均一眼为高眼压模型眼，另一眼为自身对照眼，每组3只兔于术后每日肌肉注射NGF 2000 BU，5组兔分别于制造模型眼后第1天、第3天、第7天、第15天和第30天处死，用透射电镜观察线粒体的变化，免疫组织化学SABC法检测RGCs的Bcl-2、Bax蛋白表达，定量分析NGF的药物疗效。结果 急性高眼压3 d后, RGCs轴突中线粒体肿胀，空泡化，Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增多，Bcl-2/Bax比值下降，实验组与对照组相比差异有显著性（t=3.09,P<0.05）；应用NGF 7 d后，治疗组线粒体肿胀程度减轻，Bcl-2表达增多，Bax表达减少，Bcl-2/Bax比值开始上升，治疗组与实验组相比差异有显著性(t=2.79,P<0.05），15 d后，轴突中线粒体增多，30 d后，线粒体形态、数量基本恢复正常，治疗组与实验组相比差异有极显著性（t=4.23,P<0.01）。结论 NGF可改善急性高眼压RGCs的营养状况，保护线粒体，上调Bcl-2/Bax比值，促进RGCs功能的恢复，减轻急性高眼压后视网膜神经节细胞的损伤。

　　【关键词】  高眼压； 视网膜神经节细胞； 神经生长因子； Bcl-2/Bax； 线粒体

　　［Abstract］  Objective  To observe in vitro the protective effect of nerve growth factor（NGF） on the retinal ganglion cells（RGCs） of rabbits injured by acute ocular hypertension. Methods  Thirty healthy adult New Zealand white rabbits were randomly divided into five groups. An injury model was established in six rabbits in each group by forcing a perfusion of normal saline solution into the anterior chamber until the intraocular pressure（IOP） reached 50 mmHg and was sustained for 6 hours in one eye. The contralateral eye of each rabbit was used as a control. Three rabbits in each group were then treated daily with NGF 2000BU intramuscularly. The optic nerve and retina were surgically removed at five different time points (1st, 3rd, 7th, 15th and 30th day) after the operation, six rabbits for each point in time. With the HRP orthograde tracing technique and transmission electron microscopy, the effect of NGF on the optic nerve was observed by detecting the changes in the ultrastructure of the optic nerve. Results from the SABC method labeling of positive Bcl-2 and Bax RGCs were statistically analyzed to detect NGF's effect. Results  Compared with the controls, the expression of the Bcl-2 gene protein had decreased and Bax was over-expressed three days after the operation. The ratio of Bcl-2/Bax decreased significantly (t=3.09, P<0.05). Swollen mitochondria were vacuolated. Compared with the experimental groups, the ratio of Bcl-2/Bax significantly increased (t=2.79, P<0.05) after using NGF for seven days and swelling was reduced in the mitochondria. There was less degeneration of mitochondria in the treated groups after fifteen days and some mitochondria recovered after using NGF for thirty days. Compared with the experimental groups, the ratio of Bcl-2/Bax markedly increased (t=4.23, P<0.01). Conclusion  NGF can improve the nutriture of RGCs, protect the mitochondria and increase the ratio of Bcl-2/Bax. NGF might prompt the recovery of RGCs after optic nerve injury induced by acute ocular hypertension.

　　[Key words]  ocular hypertension； retinal ganglion cells； nerve growth factor； Bcl-2/Bax； mitochondria

　　关于急性高眼压视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)损伤，目前的治疗多侧重于降低眼压，但是，往往在眼压控制到正常范围之后，视神经的损害仍在继续。本实验应用透射电镜技术观察RGCs轴突线粒体的变化，应用SABC法（链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法）检测视网膜神经节细胞Bcl-2和Bax的表达，定量分析神经生长因子（nerve growth factor, NGF）的治疗效果，旨在探索一种能够对急性高眼压RGCs损伤起保护和治疗作用的药物，为临床治疗该病提供新途径。现将结果报告如下。

　　1  材料和方法

　　1．1  动物选择  健康成年新西兰大耳白兔30只，体重2.5~3.0 kg，无眼疾患，雌雄兼用。

　　1．2  分组与取材  将30只兔随机分为5组，每组6只，每只兔一眼用前房内灌注生理盐水法使眼压升高到50 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，并维持6 h，制成高眼压模型眼，另一眼为自身对照眼。每组中有3只兔在制成高眼压模型眼后每日肌肉注射神经生长因子（烟台北方制药有限公司产品）2000 BU, 作为治疗组, 其余3只兔为实验组。5组兔分别于制成高眼压模型眼后第1天、第3天、第7天、第15天和第30天处死，摘除眼球，立即放入冰生理盐水中。

　　1．3  取材及电镜标本的制作  剪取球后3.5~5.0 mm处长约1.5 mm的一段视神经，置于2.5%戊二醛中前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色。JEM-1200EX型透射电镜（日本JEOL公司生产）观察。

　　1．4  SABC法检测RGCs Bcl-2/Bax基因蛋白的表达

　　1．4．1  取材  取视乳头水平颞侧约3 mm × 5 mm大小的视网膜组织，置于10%中性甲醛中固定，常规石蜡包埋。

　　1．4．2  SABC法试剂  Bcl-2/Bax免疫组化染色试剂盒及APES (3-Amino propyltriethoxy silane) 粘片剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。DAB（四盐酸二氨基联苯胺）为瑞典Fluka公司产品。

　　1．4．3  免疫组织化学染色  两种抗体均采用SABC法染色，DAB显色，以PBS替代一抗做阴性对照。

　　1．4．4  结果判定  细胞浆内出现棕褐色细微颗粒为阳性。采用VIDAS显微图像分析系统（德国Opton公司）测量RGCs的平均积分光密度，所得结果进行t检验（SPSS统计分析软件）。

　　2  结果

　　2．1 透射电镜观察结果  正常视神经髓鞘完整，轴浆均匀，轴浆内可见清晰的正常微管、微丝和线粒体。高眼压损伤后第1天，实验组部分视神经轴突结构紊乱，线粒体肿胀，双层膜结构不清，部分嵴消失，个别空泡样变。高眼压损伤后第3天，实验组多数轴突极度肿胀，层次丧失，线粒体数目减少，空泡化，双层膜结构和嵴均消失(见图1)。高眼压损伤后第7天，实验组视神经结构改变基本同第3天组。治疗组轴突肿胀轻，线粒体较实验组多见。高眼压损伤后第15天，实验组部分轴突明显萎缩，线粒体肿胀程度较前减轻。治疗组轴突肿胀轻，线粒体数量较实验组多，且结构较完整。高眼压损伤后第30天，实验组轴突部分萎缩，幸存轴突髓鞘结构较完整，线粒体略多，结构仍未完全恢复正常。治疗组轴突无肿胀，仅少数萎缩，线粒体数量增多，结构接近正常(见图2)。

　　2．2  急性高眼压损伤后，应用SABC法检测RGCs Bcl-2/Bax基因蛋白阳性表达的积分光密度，实验组与对照组以及治疗组与对照组之间，平均积分光密度值的差异比较见表1。

　　3  讨论

　　青光眼视神经损伤的病理基础是视网膜神经节细胞及其神经纤维的丧失，在青光眼RGCs损伤中，线粒体、Bcl-2/Bax和细胞凋亡三者之间的关系是近几年的研究热点，治疗的最终目标在于阻止视神经的损害，保护视功能[1]。

　　3．1  高眼压对RGCs线粒体超微结构的影响

　　研究表明，线粒体功能障碍在神经元损伤中发挥重要作用，线粒体膜的不稳定性和通透性变化是细胞凋亡的机制之一[2]。在急性眼压升高后，轴浆运输受阻，细胞骨架蛋白的结构受到破坏，不能向前延伸，线粒体因得不到充足的营养物质和氧的供应而发生变性，数目减少，能量代谢产生障碍，ATP含量下降，造成胞膜内、外物质的主动转运因能量缺乏而趋向停止，使得视神经通透性和组织液的含量增加，轴突肿胀、变性，可能集中影响到线粒体产生通透性转变（mitochondrial permeability transition，MPT）[3]， MPT是由线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放所引起的，MPTP的不可逆过度开放可导致ATP合成停止，线粒体外膜破裂，细胞色素c (cytochrome c, Cyto c)和凋亡诱导因子释放于细胞浆，最终导致细胞凋亡。本研究发现，急性高眼压3 d后, RGCs轴突中线粒体数目减少，空泡化，甚至破裂；7 d后，NGF治疗组线粒体肿胀程度减轻，Bcl-2/Bax比值开始上升；15 d后，轴突中线粒体增多；30 d后，线粒体形态、数量基本恢复正常。这就从超微结构病变发展的角度提示，RGCs凋亡乃至死亡均可能继发于持续眼压升高引起的RGCs线粒体超微结构的损害。线粒体的结构破坏与功能缺失，造成RGCs退行性变性萎缩，是导致RGCs凋亡乃至死亡的机制。因此，青光眼治疗的首选措施应为采取有效手段充分降低眼压，进而采用神经营养类药物，保护视神经，阻止RGCs凋亡。

　　3．2  高眼压对RGCsBcl-2/Bax蛋白表达的影响

　　已知青光眼的病理改变特征是RGCs的缺失，近年的研究发现，RGCs凋亡在高眼压所致的视神经损伤中起重要作用。细胞凋亡是一种由基因控制的细胞主动、有序的死亡方式，可被Bcl-2/Bax以及NGF等基因和细胞因子所调控，其中Bcl-2/Bax为重要的凋亡调控基因，二者定位于线粒体膜，可通过调节线粒体功能而制约凋亡的发生。体外实验发现，Bcl-2与Bax等蛋白能够二聚化，形成离子或蛋白出入的通道，改变线粒体的结构，参与细胞凋亡的调控。通常情况下，Bax分布于细胞浆，而Bcl-2则分布于线粒体外膜、内质网及核膜的胞浆面。当凋亡启动，信号传递至胞浆后，Bax迅速从胞浆移位到线粒体外膜，与MPTP杂二聚化，导致MPTP通透性增加，Cyto c释放[4]。Bax也可同源二聚化，在线粒体外膜形成孔道，引起Cyto c释放。而Bcl-2则能抑制Bax的二聚化或与MPTP发生作用，从而阻止Cyto c释放。细胞可因生存环境的变化而激发凋亡，提示凋亡由细胞自身调节，本实验在急性眼压升高（6.67 kPa, 持续6 h）这一特定条件下，可能同时激活两种凋亡调控基因Bcl-2/Bax，它们各自发挥保护或损伤作用，共同调节RGCs的凋亡过程。通过比较实验组与治疗组Bcl-2/Bax的表达水平发现，急性高眼压后3 d时，Bcl-2/Bax比值下降，7 d后，治疗组Bcl-2/Bax比值开始上升，根据这一结果我们认为，1 d、3 d时，促凋亡基因Bax表达增加，抑凋亡基因Bcl-2表达降低，Bcl-2/Bax比值降低，Bax由胞浆转向线粒体，Cyto c从线粒体释放到胞浆，激活caspase-9和caspase-3，促使凋亡蛋白执行凋亡程序，细胞趋于凋亡[5]；NGF应用7 d后，随着其效能的发挥，治疗组Bcl-2基因蛋白的表达开始升高，Bcl-2/Bax比值增大，抑制高眼压所引起的RGCs损伤，细胞趋于存活。Bcl-2家族中抗凋亡成员和促凋亡成员的表达比值在决定急性高眼压视神经损伤过程中RGCs是否凋亡起关键作用[6]。

　　3．3  NGF对高眼压视神经损伤的保护作用

　　神经生长因子含有细胞生长激活物质和生物活性因子，具有加速受损伤的神经细胞组织蛋白合成，调整核酸代谢和糖代谢，增加细胞能量供给的作用[7]。急性高眼压7 d后，NGF治疗组线粒体肿胀程度减轻，Bcl-2/Bax比值开始上升；15 d后，轴突中线粒体增多；30 d后，线粒体形态、数量基本恢复正常。因此，NGF对RGCs的保护作用很可能是通过保护线粒体，预防发生不可逆的MPT，抑制其凋亡实现的。NGF可保护RGCs细胞膜和细胞器的稳定性,可能通过影响Bcl-2/Bax的相对表达量，调整MPT的开放程度，而参与了细胞凋亡的调控。Bcl-2基因家族可分为抑制细胞凋亡基因和促进细胞凋亡基因，两组基因表达出的效应取决于此两组基因的比例关系和蛋白准确定位，Bcl-2蛋白抗凋亡能力依靠其在线粒体的正确定位[8]。RGCs中具有NGF及mRNA受体，与外源NGF结合后，靶细胞的超微结构和化学特性都可产生明显的变化，通过挽救线粒体，预防发生不可逆的MPT, 抑制凋亡基因表达，阻断死亡基因毒性产物的功能，最终可能干预凋亡细胞的死亡，减少RGCs的损伤。

　　本实验观察了NGF对急性高眼压RGCs线粒体超微结构的影响和对Bcl-2/Bax表达的影响，推测NGF可以改善急性高眼压RGCs的营养状况，保护线粒体，并在一定程度上抑制急性高眼压作用下RGCs中Bax的表达，提高Bcl-2基因蛋白表达水平。它可通过影响Bcl-2/Bax的相对表达量，而影响MPT的开放程度，控制RGCs凋亡相关基因产物的表达，促进RGCs功能的恢复，从而减少RGCs的凋亡，减轻急性高眼压后视网膜神经节细胞的损伤。

　　【参考文献】

　　[1] Guan QH, Pei DS, Liu XM, et al. Neuroprotection against ischemic brain injury by SP600125 via suppressing the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis[J]. Brain Res, 2006,1092(1):36-46.

　　[2] Neumar RW. Molecular mechanism of ischemic neuronal injury[J]. Ann Emerg Med,2000,36(5):483-506.

　　[3] Cardoso CM,Almeida LM,Custodio JB. Protection of tamoxifen against oxidation of mitochondrial thiols and NAD(P)H underlying the permeability transition induced by prooxidants[J]. Chem Biol Interact,2004,148(3):149-161.

　　[4] Cao G, Minami M, Pei W, et al. Intracellular Bax translocation after transient cerebral ischemia: implications for a role of the mitochondrial apoptotic signaling pathway in ischemic neuronal death[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(4):321-333.

　　[5] Movsesyan VA, Yakovlev AG, Dabaghyan EA ,et al. Ceramide induces neuronal apoptosis through the caspase-9/caspase-3 pathway[J]. Biochem Biophys Res Commum，2002，299(2):201-207.

　　[6] Yu AC, Yung HW, Hui MH, et al. Cycloheximide and actinomycin D delay death and effect bcl-2,bax,and Ice gene expression in astrocytes under in vitro ischemia[J]. J Neurosci Res，2003，74(2):318-325.

　　[7] Thanos C, Emerich D. Delivery of neurotrophic factors and therapeutic proteins for retinal diseases[J]. Expert Opin Biol Ther, 2005,5(11):1443-1452.

　　[8] Huang YC, Chuang LY,Hung WC. Mechanisms underlying nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced p27(Kip1) expression[J]. Mol Pharmacol，2002，62(6):1515-1521.