作者：张林，邢咏新，刘蓉，王玉英    作者单位：西安交通大学第一附属医院 眼科，陕西 西安 710061；2.天津医科大学眼科临床学院，天津市眼科医院，天津 300070；3.山西省大同医学院附属医院 眼科，山西 大同 037008；4.第四军医大学 神经生物学系， 陕西 西安 710032

    【摘要】  目的 通过测定体外培养兔角膜内皮细胞（rabbit corneal endothelial cells，RCECs）静息电位及全细胞电流，初步研究角膜内皮细胞的电生理特性。方法 采用后弹力层及内皮层揭取联合组织块法进行RCECs体外培养，采用膜片钳全细胞记录模式记录原代及传代RCECs细胞静息电位及全细胞电流，绘制电流—电压（I/V）曲线。结果 体外培养原代RCECs的平均静息膜电位水平为（20.9±1.7）mV（n=6），第2代RCECs的平均静息膜电位水平为（15.1±1.8）mV（n=6），两者差异有统计学意义（P<0.01）。在钳制电位+60 mV下，原代RCECs全细胞电流为（396.2±39.0）pA（n=5)，大于第2代RCECs的全细胞电流（201.4±45.2）pA（n=5)，差异有非常显著的统计学意义（P<0.01）。结论 后弹力层及内皮层揭取联合组织块法获得的原代及传代RCECs，在静息电位和全细胞电流等电生理特性方面存在差异。

    【关键词】  角膜内皮细胞；细胞培养；膜片钳；细胞电生理

     角膜的透明性是维持视觉器官正常生理功能的重要条件。角膜内皮细胞层是维持角膜透明性的重要结构。由角膜内皮细胞病变引起的致盲性眼病已经成为危害人们尤其是老年患者的重要致盲眼病之一。角膜内皮细胞体外培养及人工角膜构建技术的日臻完善，为供体短缺的角膜移植手术带来了希望。

    随着膜片钳技术的广泛应用，国外许多学者已将该细胞电生理研究技术应用于角膜内皮细胞的生理、病理以及药物疗效评价等方面，取得了较大的进展。国外的研究结果表明角膜内皮细胞中存在许多不同类型的离子通道，这些离子通道对维持角膜内皮细胞的泵功能及角膜透明性具有重要作用。而国内对于角膜内皮细胞电生理特性的实验研究少见报道。本研究采用膜片钳全细胞记录模式对体外培养兔角膜内皮细胞的静息电位及离子电流进行测定，初步探索角膜内皮细胞电生理研究方法。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  健康成年新西兰白兔，雌雄不限，体重为1.5～2.0 kg，由西安交通大学医学院动物中心提供。

    1.1.2  主要仪器设备  CO2培养箱3111（FORMA公司），倒置相差显微镜DMIRBHC（Leica公司），医用超净化工作台SWCJIF（苏州安泰空气技术公司），高速离心机（北京医用离心机厂）。Axon 200B膜片钳放大器（Axon公司），Axon 1200型D/A－A/D转换器（Axon公司），PP-83垂直微电极拉制仪（Narishige公司），Leitz DM 1 L倒置显微镜（Leica公司），M0-103型微操纵仪（Narishige公司），HY-8020型A/D转换器（北京华远计算机公司），计算机为Pentium Ⅱ(266MHz)兼容机，有芯玻璃微电极（外径1.4 mm，南京泉水教学实验器材厂），防震台（上海亿奥公司）。

    1.1.3  主要试剂及溶液  RPMI1640培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），2.5%胰蛋白酶（GIBCO公司），L-谷氨酰胺（SIGMA公司）2 mM/L，ConA条件化上清液（由第四军医大学空医系细胞培养室提供）。条件化培养基：每100 ml RPMI1640培养基中分别加入10 ml ConA条件化上清液，10 ml胎牛血清，1 ml L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素。庆大霉素（天津华津制药厂），葡萄糖酸钾（K-Gluconate，Sigma公司），EGTA（上海华美医药试剂公司），HEPES（上海华美医药试剂公司）。标准电极内液：K-Glucose 140 mM，MgCl2 2 mM，EGTA 3 mM，HEPES 10 mM，以1 M KOH调整为pH＝7.4。标准细胞外液：NaCl 150 mM，KCl 5 mM，MgCl2 1 mM，CaCl2 3 mM，Glucose 10 mM，HEPES 10 mM，以1 M NaOH调整为pH＝7.4。

    1.2  兔角膜内皮细胞（rabbit corneal endothelial cells，RCECs）体外原代培养  采用揭取后弹力层及角膜内皮细胞层联合组织块法进行兔角膜内皮细胞体外原代培养。乙醚吸入麻醉后，摘取兔眼，去除眼球附属组织，以4×104 U/L的无菌生理盐水冲洗浸泡眼球30 min。在超净工作台内，将眼球置于无菌培养皿的D-Hanks液中，在立体视解剖显微镜下，于角膜缘内1 mm 360°环形剪取角膜片（corneal button），内皮面向上，沿角膜片边缘揭取内皮细胞层，并切割成1 mm×2 mm大小的组织块，内皮面向下置于0.1％明胶及胎牛血清预处理的无菌培养瓶中，铺平展开组织块。于37°C、5％ CO2培养箱中孵育、贴壁4 h后，加入条件化培养基，置于培养箱中继续孵育。72 h后首次更换培养液，以后每3天换液1次。

    1.3  RCECs传代培养  细胞生长接近融合期或局部密度较大时进行传代。倾去原培养液，以D-Hanks液清洗。加入0.25％胰蛋白酶1 ml，于37°C、5％ CO2培养箱中消化3~5 min。在倒置显微镜下观察见细胞胞体回缩、变圆，即加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化。吸管适度轻轻吹打至细胞脱落，将细胞悬液移至5 ml离心管中，1500 r/min离心5 min，弃上清液，注入新鲜培养液，重悬细胞，按8×104～1×105个/L密度接种于培养瓶中，置于37°C、5％ CO2培养箱中继续孵育，按常规换液，待细胞融合，同法传代。

    原代及第2代RCECs通过神经烯醇化酶（neurone-specific enolase，NSE）染色进行鉴定，证明其神经嵴来源，具体方法参考本课题组既往研究结果[1]。

    1.4  RCECs电生理研究

    1.4.1  细胞准备  取原代及第2代RCECs，消化后置于细胞记录槽中贴壁2 h，以重力法灌流细胞浴池液3~5 min，更换原培养液。在倒置相差显微镜下观察细胞形态，选择活性较好的细胞作为记录细胞，即：细胞折光性好、立体感强，细胞膜干净光滑完整、胞质均匀、细胞富有光泽。以100% O2气体（2 ml/min）持续灌流记录槽内细胞。

    1.4.2  RCECs静息电位及全细胞电流测定  实验当日取外径1.4 mm、内径0.8 mm的毛细玻璃毛坯，采用两步法拉制电极，尖端直径1~2 μm，电极电阻3~5 MΩ。充灌电极内液，室温（25℃）下，采用全细胞模式进行记录。注射器负压吸引，达GΩ巨阻封接。脉冲式负压或ZAP破膜，形成全细胞记录状态。在电流钳状态下，给予0 nA钳制，记录细胞静息膜电位（resting membrane potential，RMP）。然后转换至电压钳状态，钳制电位-20 mV，阶跃电压为20 mV去极化，-120～+100 mV，脉冲时间250 ms，间隔时间1 s，5 Hz低通滤波，记录全细胞膜电流变化。测得全细胞电流均经电流—电压转换。采用Microcal公司Origin ６.０绘图软件做图。取每一刺激过程最后400 ms的电流均值进行Clampfit 8.0统计处理。n为检测的细胞数。

    1.5  统计学方法  采样软件使用Clampex 8.0软件，数据分析及绘图采用Clampfit 8.0及Origin 6.0软件。统计学方法采用SPSS 13.0 One-way ANOVA。2　 结果

    2.１　 成功实现RCECs体外原代及传代培养  原代RCECs培养72 h后，即可见内皮细胞自组织块边缘迁出，细胞呈多角形，近组织块部位细胞呈现典型内皮细胞多角形形态，鹅卵石样或不规则形（见图1-A）；原代生长7 d左右，细胞生长最旺盛，形成以组织块为中心的生长密集区，细胞呈多角形、圆形或鹅卵石状，可见细胞间汇合，呈单层片状（见图1-B）；细胞生长至10 d左右，细胞汇合率约为80％，接近融合期时进行传代培养。

    传代后RCECs 24 h贴壁，呈多角形、类圆形或圆形，传代后第3~5天为细胞生长旺盛期，随细胞数增加，细胞逐渐呈典型的角膜内皮细胞多角形形态，细胞单层生长，胞浆丰富，核仁明显，细胞连接开始形成。传代细胞生长至第7天可达到融合状态（见图1-C）。

    2.２  RCECs电生理参数记录结果  体外培养原代RCECs与第2代RCECs平均静息膜电位水平差异有非常显著的统计学意义（P<0.01），见表1、图2。钳制电位为+60 mV时，原代RCECs的全细胞电流明显大于第2代（P<0.01），见表1、图3。

    本实验中，在相同记录条件下，所记录电流变异较大。巨阻封接细胞后，2个细胞（2/5）出现一个快相、短时程的方向向下的微小内向电流，而后变为外向电流，并随电压逐渐增大，并呈时间依赖性。3个细胞（3/5）仅可见外向电流，超极化下未见明显的内向电流。状态良好的RCECs可观察到完整的全细胞电流。

    3  讨论

    3.1  RCECs原代及传代培养  本实验采用揭取后弹力层及角膜内皮细胞层法结合组织块法成功实现RCECs的原代培养[2-3]。使用本研究小组既往实验中作为细胞生长佐剂的刀豆蛋白A（concanavalin A， Con A）的条件化培养基，促进细胞生长。

    实验结果显示，原代RCECs在组织块贴壁72 h后即可自组织块边缘迁出，呈多角形、卵石样排列。本实验中选用生长5~7 d原代RCECs进行实验操作，细胞生长10 d左右，汇合率达80％以上时进行传代。第2代RCECs细胞呈多角形、卵石状，传代细胞在5~7 d时即形成单层细胞，此时细胞活性最佳，可进行实验操作。

    3.2  体外培养RCECs电生理特性研究  Neher等［4］于1976年建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。该技术以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道活动。以后由于吉欧姆阻抗封接（gigaohm seal，109 Ω）方法的确立，使其测量电流分辨率可达到1 pA，其电极尖端直径仅有几个微米，故对于体积较小、脆性较大的细胞亦可进行电压钳制，从而可用于多种细胞的研究。膜片钳技术的出现迅速将生命科学研究推进到细胞和分子水平。

    国外学者利用此技术对角膜内皮细胞做了大量研究工作，在角膜内皮细胞的电生理特性、生物学意义方面取得了一定的研究进展。

    研究发现角膜内皮细胞上存在多种离子通道，如Na＋通道、K＋选择性离子通道、非选择性阳离子通道、Ca2＋通道等［5-7］，其中K＋离子通道与静息电位关系最为密切。有研究表明，兔角膜内皮细胞上存在着一种温度敏感性的K＋离子通道，温度升高可增加其电导，被认为是角膜内皮细胞静息电位的主要来源[8]。在内皮细胞的K＋离子通道中的Kir2.1 mRNA序列对于细胞静息电位的维持具有重要作用［9］。Watsky等［10］利用传统全细胞膜片钳和穿孔性膜片钳技术分别检测新鲜分离的兔角膜内皮细胞的离子电流，记录到一种与可兴奋细胞的A电流类似的电流，呈现外向性、整流性、非选择性K＋离子瞬时电流。这一电流可被奎尼丁和4-氨基吡啶以剂量依赖性方式阻断，同时引起角膜内皮和基质的水肿，编码K＋离子通道kv3.3的氨基酸序列是产生A电流样电流的结构基础，研究证实这一通道对于内皮细胞及基质的容量调控具有重要作用［9］。

    Mergler等[7]的研究首次证实L型Ca2＋通道与成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶的关联，对于研究活体及培养的人角膜内皮细胞的功能具有重要价值。而Rae等［11］利用两性霉素B穿孔性膜片钳技术对机械及热损伤的兔角膜内皮细胞的研究中发现，在损伤的角膜内皮细胞中，正常状态下的K＋通道电流消失，而表现为一种非选择性的阳离子电流。这一损伤诱导的通道电流是一种外向性整流性电流，在细胞膜去极化时具有活性，可被奎尼丁、氟灭酸及醋酸盐抑制。正常状态下的内皮细胞则不表现这一特征电流。本实验发现原代RCECs较第2代细胞更接近在体状态，细胞活性状态最佳，易于封接。

    角膜内皮细胞的膜电位是反映细胞膜上离子传导性的纯粹数值。目前的研究方法有微电极法、 放射性检验、电压敏感性染色及膜片钳技术[8，12-14]，其中以膜片钳技术应用最为普遍。由于角膜内皮细胞非选择性阳离子通道的存在[11]，离子通过该通道仅需电压驱动，当阻断通过此通道的电流并将细胞的电流钳制在0 mA后，所测定的电压值即为膜电位[13]。

    本实验获得的RCECs膜静息电位绝对值小于钾离子的平衡电位（－90 mV）的绝对值，可能由于细胞膜上存在其他离子通道，改变了膜电导。此外，生电性转运体的（如钠泵）活性和细胞的输入阻抗也会影响细胞的静息膜电位。研究发现阴离子激活的钾通道在生理状态下仅部分开放，形成细胞的输入电导。角膜的透明性与角膜内皮细胞的静息电位密切相关，主要与K+通道有关。当K+再循环通路受阻，导致水肿发生。研究已证实编码通道Kir3.3[11]及Kir2.1[9]的氨基酸序列，后者表达产生内向整流的钾离子电流，可被外源性Ba2+和Cs+阻断，并呈现电压和浓度依赖性，该通道与角膜内皮细胞的膜电位调节、内皮细胞的跨膜转运等功能有关[15-16]。

    全细胞模式下记录的全细胞电流系宏观电流，包含了多种离子通道的综合作用，电流包含各通道的成分。通过改变实验条件，可以分离各种通道电流，如控制灌流液的温度、特定的刺激程序以及特异性的工具药在一定的实验条件时，可将另外一种或几种通道电流阻断，从而得到单一通道的电流。本研究中所记录的全细胞电流以外向电流为主，可能主要是A电流和K+通道电流。实验中所记录到的内向电流可能由阴离子选择性K+通道、Na+通道、Ca2+通道等共同形成。本实验中原代细胞较第2代细胞的全细胞电流大，提示原代培养的RCECs电生理特性更接近活体细胞状态。在本研究记录过程中发现的电流变异，可能与细胞状态有关。出现的快相、短时程的的微小内向电流可能与生电钠泵或A电流相关。具有电压及时间依赖性的外向电流应当为K＋通道开放所致。状态良好的RCECs可观察到完整的全细胞电流。

    本研究成功建立了体外培养RCECs全细胞模式记录方法，是对角膜内皮电生理学方面的初步探索。相信在此基础上，会推动角膜内皮细胞的电生理功能研究向纵深发展。

    【参考文献】

    [1] 邢咏新，张林. 刀豆蛋白A条件化培养基对体外培养兔角膜内皮细胞生长的影响[J]. 西安交通大学学报，2008，29(4)：374-378.

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