作者：刘兰涛，夏峰，范馨燕，郭群，张磊，张作明    作者单位：第四军医大学 航空航天医学系航临教研室，陕西 西安 710032；2.哈尔滨工业大学 可调谐激光国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001 

    【摘要】  目的 探讨用植入电极方式记录豚鼠图形视觉诱发电位（pattern visual evoked potential，PVEP）的方法。方法 豚鼠麻醉后，暴露颅骨表面，在前囟（Bregma）前6 mm、后10 mm及矢状缝正中处钻孔，均植入长5 mm、直径为1.2 mm的不锈钢螺钉，分别作为参考电极、记录电极和地极。3 d后，将清醒状态下的豚鼠固定于自制多功能头身一体化固定台面上，银—氯化银电极连接于豚鼠体表的不锈钢螺钉上，采用RETI-port系统(Roland Consult，德国)分别记录不同空间频率和不同颜色下的图形视觉诱发电位。结果 植入电极后，在无出血感染条件下，实验豚鼠生存时间与正常豚鼠没有明显区别。在其清醒状态下可以记录到豚鼠的PVEP波形，呈NPN形状。空间频率对PVEP波形有明显的影响：随着空间频率的增加，N1、P1波的潜伏期都有不同程度的延长，当空间频率大于0.5 cpd时，潜伏期延长明显；随着空间频率的增加，振幅降低。在不同对比度（97%、60%、30%）下，P1波的振幅随着对比度的增加而提高，且任意两个对比度之间P波振幅的差异均有统计学意义（P<0.05）。在97％和60％的对比度下，潜伏期差异无统计学意义（P>0.05）。不同颜色图形对PVEP波形也有一定的影响，黑白和红绿引出的潜伏期和振幅比较明显，与红蓝和蓝绿比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。当通频带为5~50 Hz时，引出的波形受干扰比较小，波形比较稳定。麻醉对PVEP记录影响较大，速眠新麻醉条件下记录不到PVEP波形，但对闪光视觉诱发电位记录影响不大。结论 本研究建立了一种植入式电极记录清醒豚鼠PVEP方法；豚鼠PVEP波形记录与刺激和记录参数密切相关，在高对比度（97%）、窄通带（5~50 Hz）、适当空间频率（小于0.5 cpd）下可以记录稳定的PVEP波形。

    【关键词】  图形视觉诱发电位；颅骨植入电极；豚鼠

    视觉诱发电位（visual evoked potential，VEP）主要是视觉刺激引起的视皮层神经元电活动，其中图形视觉诱发电位（pattern VEP，PVEP）与视网膜对图像的识别密切相关，与人的视力密切相关，且图形比较稳定，因此被广泛用于临床。而闪光视觉诱发电位（flash VEP，FVEP）个体间变异较大，多用于PVEP无法记录或记录不到的情况。常用的实验动物如小鼠和大鼠形觉功能较差，很难记录到明显和稳定的PVEP，多采用FVEP指标进行观察。而豚鼠形觉功能较好，能够诱发出PVEP，但是采用皮下电极记录振幅较低，且重复性不好，因此记录比较困难[1]。有关动物PVEP的研究比较少，van der Marel等[2]发现恒河猴在麻醉状态下，不能记录到明显的PVEP图形，其清醒状态下的PVEP才能同光刺激产生的电位区分开来，且随着麻醉深度的加深，脑电图的高频波逐渐消失，由此可知，诱发电位也会受到麻醉状态的影响。豚鼠作为一种重要的实验动物，已经被广泛地应用于传染病学、药理学以及内耳疾病等方面的研究，但在眼科学领域应用相对较少，有关豚鼠视觉电生理学方面的研究则更少[3-4]。借鉴植入电极记录大鼠VEP的经验[5]，我们建立了在颅骨植入电极且在清醒状态下记录豚鼠的方法，为今后的应用研究奠定基础。

    1 　材料与方法

    1.1 　实验动物　 健康成年雄性豚鼠15只(第四军医大学实验动物中心提供) ，体重220~300 g，外眼和检眼镜查屈光间质清晰，眼底无改变。予以12 h明暗交替光照，不限食水，在18℃～23℃条件下饲养。

    1.2  实验方法

    1.2.1  电极植入方法  1%戊巴比妥按1.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，将豚鼠呈俯卧位固定于手术台上，四肢及头部固定牢固，弯剪除去头顶周部皮毛，直至露出皮肤，用碘氟、75%的酒精依次消毒皮肤，沿头颅矢状缝剪开皮肤2 cm，根据Goksoy等[6]介绍的豚鼠脑功能定位图进行电极固定，在前囟（Bregma）前6 mm以及后10 mm分别做参考电极和记录电极，头顶正中做地极。缝合皮肤，放回饲养笼单独饲养，于术后第1、第3天消毒切口处。为了减轻麻醉的影响，3 d后进行实验。实验完成后，对豚鼠进行饲养并观察7 d，以便观察植入电极对豚鼠生存时间的影响。

    1.2.2  豚鼠固定  将豚鼠固定于自制多功能头身一体固定台上，然后将银—氯化银电极连接于不锈钢螺钉上，连接放大器 。连接好后将其置于安静、亮度为120Lux的操作室中。每只豚鼠都以右眼为测试眼，左眼用黑色蔽光罩罩上，右眼角膜缘与显示屏平行，距离显示屏中心20 cm，视角为36.9°，安静3 min后测量。

    1.2.3  PVEP记录  采用RETI-port视觉电生理学记录系统(Roland Consult，德国)，ELSA 21寸彩色显示器，棋盘格(checkerboard)翻转刺激，刺激频率为2.0 Hz，显示屏亮度为25 cd/m2，扫描时间300 ms，通频带初始设为5～50 Hz，根据试验需要，实验中通频带需要改用1~100 Hz，叠加80~120次。记录时电极间电阻小于5 kΩ。按照RGB格式并且采用OptiCAL(Japan)测量亮度，刺激棋方格颜色参数分别为黑（0.0.0，5.0 cd/m2）、白（255.255.255，75.0 cd/m2）、红（255.0.0，24.5 cd/m2）、绿（0.255.0，45.5 cd/m2）、蓝（0.0.255，22.5 cd/m2）。根据实验需要，灰度的对比度可分别设置为97％、60%、30%。

    1.3  统计学方法 　应用RETI-port软件测量PVEP的N1波潜伏期、P1波潜伏期以及N1P1的幅值。使用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析。

    2 　结果

    2.1  一般情况  在实验期间，豚鼠死亡3只，死亡时间分别是术后第1、第3和第7天。尸检发现：术后第1天死亡的豚鼠颅内出血，血液充满整个颅腔；术后第3天死亡的豚鼠鼻腔周围有血凝块，肺部充满血液，胸腔积液，心脏明显变大；术后第7天死亡的豚鼠切口化脓，脑组织表面及内部积脓。其余豚鼠在观察的7 d中未见到异常，生命状态良好。　

    2.2  正常豚鼠的PVEP的波形特点  正常豚鼠清醒状态下，植入电极引导出来的波形为NPN形，与人类的PVEP诱发图形相似。图形起始为一深大的负波，随后为一较大正波，后为负波后电位(见图1)。不同影响因素下，PVEP波形变化不大。在0.1 cpd的空间频率下，负相N1波的潜伏期为（61.19±5.81）ms，正相P1波潜伏期为(93.60±4.84) ms，N2波潜伏期为(127.25±8.56)ms，N1P1的振幅为(11.18±2.67)μV。

    2.3　 空间频率对图形视觉诱发电位的影响  空间频率指单位视角所对应的黑白方格组数，用cpd和方格各边所对应的视角两种方式来表示。本实验主要观察不同空间频率时，N1、P1潜伏期以及N1P1振幅的变化情况(见图2)。当棋盘格变小时，即单位视角所对应的黑白方格组数变多、空间频率变大时，N1、P1的潜伏期都有不同程度的延长。当空间频率从0.1 cpd增加到0.5 cpd时，N1、P1的潜伏期变化不明显(P>0.05)；但当空间频率从0.5 cpd增加到0.9 cpd时，N1、P1潜伏期明显延长，几乎呈线性关系；空间频率为0.9 cpd时，与0.1、0.3、0.5 cpd时比较，N1、P1的潜伏期差异均有统计学意义(P<0.05)（见图3和图4）。图3、图4中N1、P1潜伏期的这种变化规律可能与棋盘格在视网膜的模糊成像有关。随着空间频率的变化，N1P1的振幅变化远没有潜伏期变化明显。在空间频率0.1 cpd与0.7、0.9 cpd比较时，振幅差异有统计学意义（P<0.05）(见图5)。

    2.4  颜色对图形视觉诱发电位的影响  我们观察了在0.02 cpd空间频率下，黑白(B-W)、红绿(R-G)、红蓝(R-B)、蓝绿(B-G)对豚鼠PVEP的影响。在不同颜色下，豚鼠对其反应的敏感性亦不同。在黑白和红绿条件下，豚鼠对图形的反应效果最好，振幅较大，黑白与红蓝、黑白与蓝绿、红绿与红蓝、红绿与蓝绿相比，N1P1 振幅差异均有统计学意义（P<0.01），而红蓝和蓝绿以及黑白和红绿之间差异无统计学意义（P>0.05）（见表1、图6）。四种不同颜色的N1及P1的潜伏期差异无统计学意义（P>0.05），见表1。典型PVEP波形图见图7。

    2.5  对比度对图形视觉诱发电位的影响  在记录过程中，我们还观察了在0.02 cpd方格大小下，不同对比度(97%、60%、30%)对PVEP的影响。当对比度从97%下降到30%时，P1波的潜伏期延长。在对比度为97％和60％时，潜伏期差异无统计学意义（P>0.05）。而对比度30％与97％、60％分别比较，潜伏期差异均有统计学意义（P<0.05）（见图8）。P1波振幅随着对比度的增加而增大，任意两者之间差异均有统计学意义（P<0.05）（见图9）。

    2.6  通频带对图形视觉诱发电位的影响  在本实验中我们选择了5~50 Hz条件下的通频带，在此条件下，波形干扰小，波形趋势较明显。通频带为1~100 Hz时，棘波较多，干扰信号较大，信噪比差。

    2.7  麻醉对诱发电位的影响  我们观察了使用速眠新Ⅱ注射液（0.8 ml/kg，解放军农牧大学兽医研究所）麻醉前后豚鼠的PVEP及明适应10 min的FVEP的变化。在相同空间频率下，麻醉前可稳定地引出PVEP图形，麻醉后未观察到明显的PVEP图形（见图10）。但是，FVEP麻醉前后波形无明显改变（见图11）。

    3 　讨论

    PVEP是由光栅条纹或棋盘方格等图像刺激诱发、在大脑皮质视觉中枢产生的生物电。从本质上讲， 属于通过信号平均技术与叠加技术从在头皮记录的脑电图中提取出的诱发电位，反映了视觉信息从视网膜到大脑皮质视觉中枢信号的传递过程[7]，一般认为PVEP的P100潜伏期的长短反映了神经传导途径中是否有阻滞，振幅主要反映视网膜后极部的感受机能，同时也受中枢传导功能的影响。PVEP检查在临床上有着广泛的用处，尤其是对视神经炎、白内障、青光眼的诊断以及司法鉴定有着突出的作用。但是PVEP信号的振幅很小， 极易受到心电、肌电的干扰，同时由于PVEP对受检者固视有要求，国内外文献关于动物PVEP报道的比较少，主要限于猴子[2，8-9]、猫[10]、家兔[11]等，限制了对PVEP进一步的研究，尤其在啮齿动物中，尚少见有关PVEP的报道。

    豚鼠属啮齿类动物，但与大鼠和小鼠不同，它是晚成熟动物，妊娠期达68~69 d，胚胎在母体发育完全，出生时即已长成，眼睛已睁开[12]。同人眼一样，在妊娠期豚鼠视网膜即有大量的杆体外节形成，待感光细胞外节发育形成前，丛状层已经形成。其视网膜上视锥细胞多于一般啮齿动物(Cone rich)，与人类有着较为相似的视椎、视杆细胞比例[12-13]，且成熟时间与人类相似[14]。在明适应中，豚鼠和人眼在组织学以及生理学上有高度的一致性[12]。因此，许多学者认为豚鼠可以作为一个较好的视觉研究的模型动物[15]。

    在视觉传导通路中，我们选择枕部视皮层(V17)作为记录电极（前囟门后10 mm），因为这个部位可以接受到更多的双眼相互作用的信号[16]。由于双眼视觉信号都传到视中枢，为了减少对被测眼的干扰，我们遮蔽另一只眼，同时在实验过程中，尽量保持外界环境的安静，以减少对豚鼠的惊吓，最大程度地减少干扰信号。

    在不同空间频率下，我们发现空间频率小于0.5 cpd时，P1潜伏期无明显延长，大于0.5 cpd时潜伏期延长明显，结果与Rimmer 等[17]报道的关于人在不同空间频率下P100变化规律相似，由此推测豚鼠的前视觉通路也可能对空间频率有依赖性。

    视觉对灰度的鉴别主要是靠视杆细胞，而对颜色的鉴别主要是取决于视锥细胞的种类。豚鼠视网膜感光细胞主要是大量的视杆细胞和少部分视锥细胞[8-9]，所以对黑白棋方格反应的PVEP振幅比其他颜色要明显。人类视锥细胞可分为短波长（S-cone）、中波长（M-cone）和长波长（L-cone）的锥体细胞，分别对蓝、绿和红光敏感。因此，人是三元色动物。Jacobs等[18]和Juliet等[19]研究发现豚鼠视锥只有两个吸收峰值，分别是λmax400 nm和λmax530 nm，因此豚鼠只有短、中波长的视锥细胞，是缺乏长波长视锥细胞的二元色动物，而且在这两种视锥细胞中，主要又是以中波长的视锥细胞（M-cone）为主[19]。本研究中，蓝（22.5 cd/m2）绿（45.5 cd/m2）亮度的差异明显比红（24.5 cd/m2）蓝（22.3 cd/m2）和红（24.5 cd/m2）绿（45.5 cd/m2）亮度差异大，但是N1P1的振幅却没有红蓝和红绿大，因此，我们认为亮度差异对豚鼠色觉的影响是不明显的。同时，也说明豚鼠对单纯的绿色或者蓝色反应比较好，尤其是绿色，这也符合Parry等[19]的报道。本研究初步观察了不同颜色对豚鼠图形视觉诱发电位的影响，但结果能否说明豚鼠能够辨别颜色还有待于深入研究。

    对比度是反映PVEP的一个重要参数。在空间频率一定的情况下，PVEP的最大反应一般来自高对比度的情况下，因此，对比度的改变，对P1波的振幅影响很大。本实验表明，随着对比度的增加，振幅明显增大。但是，P1波的潜伏期变化并不是很明显，尤其是对比度为97％和60％时，两者之间潜伏期差异并无统计学意义。张忠志等[20]报道对比度降低可以延长P波的潜伏期和降低振幅，但是只有在对比度低于20%~40%时才出现此种效应。豚鼠是否存在此种效应，还有待于进一步研究。

    由于图形视觉诱发电位的客观性，此项检查已经广泛地应用于眼科临床和司法鉴定中，但临床应用中尚无统一标准。Brooks等[9]在恒河猴体重增加其图形视觉诱发电位被动衰减的研究中认为，恒河猴体重越重，颅骨外软组织愈厚，电阻越大，因此图形视觉诱发电位的振幅越小，其中恒河猴颅骨的厚度以及骨密度无明显的区别。这就提示我们在临床检查之中，对于肥胖患者图形视觉诱发电位的衰减是由于视觉通路原因引起的，还是由于颅骨外软组织增加电阻加大引起的需要加以辨别。为了消除软组织厚度的影响，制定客观统一的临床诊断标准，我们采用植入电极记录诱发电位的方法，为临床检查中根据不同体重的患者采用不同方式的检查提供了理论依据。

    在实验过程中，3只豚鼠的死亡时间分别为术后第1、第3和第7天。其中术后第1天死亡豚鼠尸检见颅内有明显积血，可能与螺钉固定过深，导致脑血管损伤有关。术后第3天死亡的豚鼠肺腔充满血液，胸腔积液，心脏膨大，估计可能由于麻醉过深、术中感染，加之环境气温低而引起急性肺炎，导致心肺衰竭死亡（脑组织检查无异常）。术后第7天死亡的豚鼠尸检见切口化脓，电极刺入脑组织，脑组织表面及内部积脓，颅腔无积血。因此，鉴于以上病例，术中、术后应注意消毒，尤其是术后前3天尤为重要。

    综上所述，豚鼠的PVEP在黑白高对比度（97%）、窄通带（5~50 Hz）、适当空间频率（小于0.5 cpd）下可记录稳定的PVEP波形。因此，植入电极记录豚鼠PVEP可以作为较好的动物模型以及研究方法应用于临床视觉电生理的相关研究，为标准化方案的建立以及临床诊断的应用提供资料。

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