作者：赵杰 作者单位：山东大学齐鲁医院眼科， 山东 济南 250012
【摘要】 目的：观察雷帕霉素(rapamycin)对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的增殖及细胞周期的作用。方法：将培养的人Tenon′s囊成纤维细胞用含不同雷帕霉素浓度的培养液培养24?h后, 用MTT法测定细胞的增殖情况，用流式细胞仪测定细胞周期的变化情况。结果：用含10、20、40、80和160?ng/ml雷帕霉素的培养液培养细胞时，细胞增殖抑制率分别为9.32%，22.55%，41.42%，42.25%，43.57%。细胞周期分析显示，雷帕霉素(40?ng/ml)作用后，G0/G1期细胞较对照组增多(41.76% vs 44.19%，P＜0.05)，S期细胞较对照组减少(45.42% vs 40.18%，P＜0.05)。结论：雷帕霉素具有抑制人Tenon′s囊成纤维细胞增殖的效果，且随浓度增加抑制作用增强，并将细胞抑制在G1期的限制点内。
【关键词】 雷帕霉素 Tenon′s囊 成纤维细胞 青光眼
［ABSTRACT］ Objective: To explore the effect of rapamycin on the proliferation and differentiation of human Tenon′s capsule fibroblasts in cell cycles. Methods: The cultured fibroblasts were treated in DMEM medium containing various concentrations of rapamycin for 24 hours. The growth of fibroblasts was measured by a methylthiazlyl tetrazolium (MTT) assay. The flow cytometry method was used to evaluate the cell cycles. Results: Proliferation of fibroblasts were suppressed by rapamycin from a dose of 10?ng/ml to 160?ng/ml(P＜0.05)． The cell growth inhibition rate treated with rapamycin concentrations of 10?ng/ml, 20?ng/ml, 40?ng/ml, 80?ng/ml, and 160?ng/ml were 9.32%, 22.55%, 41.42%, 42.25%, and 43.57% respectively. The cell population was significantly increased at the G0/Gl phase from 41.76% to 44.19% and decreased at the S phase from 45.42% to 40.18% after the rapamycin treatment． Conclusion: Rapamycin is a potential inhibitor that blocks the proliferation of human Tenon′s capsule fibroblasts at the Gl restriction point．
［KEY WORDS］ Rapamycin; Tenon′s capsule; Fibroblasts; Glaucoma 青光眼滤过术后纤维增生是导致青光眼手术失败的主要原因，局部成纤维细胞在术后创伤愈合过程中起关键作用［1］。目前临床常用抗代谢药、激素等预防青光眼术后滤过道瘢痕形成，由于其具有持续性低眼压及低眼压性黄斑病变等不良反应，使其临床应用受限［2］。
雷帕霉素(rapamycin) 为一种新型的大环内酯类免疫抑制剂，可以抑制平滑肌细胞［3］等多种细胞的增殖。本实验观察雷帕霉素对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的抑制作用，为寻找有效的防治青光眼滤过术后瘢痕化的新药提供理论及实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 DMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、MTT(Sigma公司)、DMSO(济南亿万泰公司)、PI(Molecular Probes 公司)、雷帕霉素（ALEXIS公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞的体外培养 人眼Tenon′s囊标本取自新鲜角膜移植供体材料的Tenon′s囊组织。将无菌取材后的组织用加入庆大霉素的生理盐水(400?U/ml) 浸泡30?min，用DHank′s 液冲洗3次后，剪成1?mm×1?mm大小的组织块，其间距约0.5?cm均匀地接种在25?cm2培养瓶中(Corning, 美国)，37?℃，5%CO2孵箱中放置1?h, 加入含20%胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素G 100U/ml，链霉素100?mg/ml)，每3 4?d换液1次。实验所用细胞为第3 8代。
1.2.2 细胞增殖抑制实验 选取处于对数生长期的人眼Tenon′s囊成纤维细胞(3 8代)， 以3×104个/孔浓度(200?μl/孔)接种于96孔培养板(Falcon, 美国)内，培养24?h后，弃原液，每孔分别加入含不同药物浓度（10、20、40、80、160?ng/ml）的培养液，空白对照组更换培养液,每个浓度及对照组设3个平行孔。继续培养24?h后,加入MTT 20?μl，4?h后，吸弃培养液，每孔加入DMSO 150?μl，振荡10?min后，在酶联免疫吸附仪上测570?nm处光吸收值(A值)。每实验重复3次。按下列公式计算抑制率。抑制率=(对照组A值－用药组A值)/对照组A值×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 选取处于对数生长期的人眼Tenon′s囊成纤维细胞(3 8代)，以无血清DMEM培养液制成细胞悬液，以5×104个/ml密度接种于25?cm2培养瓶中，常规培养24?h，使细胞同步化后，得到静止期细胞。实验组更换为40?ng/ml雷帕霉素的DMEM培养液，对照组为不含雷帕霉素和血清的DMEM培养液。培养24?h后尽弃培养液，用PBS洗2遍，加入少量的0.25%胰蛋白酶消化后，弃胰酶并以无钙镁的PBS洗2遍，再以0.5 1.0?ml无钙镁PBS吹打成单细胞悬液，收集细胞，移入离心管；1?000?r/min离心5?min，弃上清液，然后分别经-20?℃的70%乙醇固定1?h，0.1%三硝基甲苯溶液透化5?min，含PI(20?μg/ml)和RNA酶(20?μg/ml)的FACS缓冲液染色30?min，离心后再以0.5ml FACS缓冲液悬浮细胞，采用流式细胞仪测定DNA荧光强度及散射光参数，用凋亡软件定量分析细胞凋亡率及细胞周期分布。
1.3 统计学处理 细胞抑制增殖实验数据用Spss10.0软件包处理，以±s表示，采用t检验。
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