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3讨论
角膜新生血管（CNV）增殖是许多角膜病变如角膜化学性烧伤、角膜炎或溃疡等共有的病理过程，严重影响视力，同时也是导致角膜移植后排斥反应的首位高危因素［3,4］。最近，大量研究证实了VEGF在血管形成中的重要作用。VEGF是一种具有自分泌和旁分泌机制的生长因子，它的基因定位于染色体6p21.3，全长14kb,由8个外显子和7个内含子组成，编码产物为34～42kDa的同源二聚体糖蛋白，亚基之间通过二硫键相连。VEGF可使血管内皮细胞增殖，微静脉通透性增加，细胞质钙聚集，诱导血管生成。因此，目前对角膜新生血管的防治主要是围绕抑制VEGF的表达来进行。在众多抑制基因表达的方法中, RNA干扰以其特有的优势而备受青睐。RNA干扰（RNA interference）是一种高度序列特异性的转录后基因沉默，它是由小干扰RNA（small or short interfering RNA,siRNA）诱导引起的同源基因抑制。siRNA由21～23个核苷酸组成，通过结合与其有互补序列的mRNA并使之降解来达到抑制靶基因表达的目的。相比于反义RNA、核酶和基因敲除等抑制基因表达法，siRNA诱导产生的RNAi具有高特异性、高效率和高成功率的优点：(1)高特异性：siRNA能选择性地引起靶基因mRNA的降解，选择是高度特异的。siRNA有3bp以上碱基错配就不能诱导产生RNAi,有时，甚至一个碱基的突变就会大大降低靶基因的封闭效果［5］；(2)高效率：线虫实验表明，RNAi可以在细胞之间传递并维持，甚至可以传至下一代，所以在细胞内RNAi途径一旦被激活，反应信号就可以被一定程度地扩增和放大［6］。有人甚至提出最低每个细胞一份拷贝的siRNA就可以封闭靶基因的表达。但此传代和放大作用在哺乳动物细胞中尚未得到证实；(3)高成功率：RNAi已经被用于线虫全基因的功能分析，研究结果表明，其中50%～80%序列选择有效，12.9%～27%的基因封闭产生了明显的异常表型。我们所用基因转染载体为脂质体。考虑到脂质体作为载体有下述优点：(1)无细胞毒性，制备简单；(2)体内代谢慢，存留时间长；(3)包裹基因容易、简便，可携带较大的DNA分子，保护目的基因不被核酸酶降解；(4)能转染的细胞类型多，而且靶细胞不需处于分裂状态。我们采用的LipofectamineTM（LF2000）脂质体，这是一种特制的阳离子脂质体试剂，其与靶DNA的磷酸骨架结合生成的复合物具有能轻易通过细胞膜从而完成转染过程的特性，转染能力很强。
本实验结果显示，碱烧伤后1d,对照组左眼角膜缘附近的血管扩张，3d角膜新生血管开始形成,5，7d新生血管逐渐增多，14d时角膜新生血管化最为严重。实验组右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒后，角膜新生血管的长度在碱烧伤3d后各时点均比注射pSilencer2.1U6 hygro空白质粒的左眼明显要短，CNV面积明显要小，时间越长差别越明显，至14d时,左眼角膜新生血管呈刷状全部长入碱烧伤斑，占据大部分角膜，而右眼新生血管较左眼明显要短且稀疏，尤其质粒注射部位几乎没有血管生长。这说明球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒可以抑制碱烧伤后CNV的形成，其抑制作用可能是通过下调VEGF mRNA的表达来实现的，其调控机制尚在进一步研究之中。
综上所述，采用球结膜下注射脂质体介导的VEGF siRNA重组质粒，可有效地抑制CNV，方法简便易行，治疗效果明显，具有一定的临床应用前景。
【参考文献】
1 Yang Y , Zhang MC,Zhang B. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor Flk1 in corneal neovascularization of rats. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi),2006;6(6):13201322
2 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,1998;391(6669):806811
3 Weisbrod DJ, Sit M, Naor J, Slomovic AR. Outcomes of repeat penetrating keratoplasty and risk factors for graft failure. Cornea,2003;22(5):429434
4 Gebhardt BM, Shi W. Experimental corneal allograft rejection. Immunol Res,2002;25(1):126
5 Randall G, Grakoui A, Rice CM. Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci USA,2003;100(1):235240
6 Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science,2002;296(5567):550553 上一页 [1] [2] |
