【摘要】 目的：探讨中间丝蛋白nestin在视神经横断大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及可能的意义。方法：制作大鼠视神经横断模型，分别于术后1，3，7d取材，制作视网膜矢状位冰冻切片，进行GS/nestin，免疫荧光双标。提取视网膜总RNA行nestin Realtime PCR半定量分析。结果：正常大鼠视网膜中几乎看不到nestin阳性染色。术后1d，在Müller细胞上出现nestin的诱导表达，术后3d，nestin在Müller细胞上的表达进一步增强，术后1wk，nestin在Müller细胞上的表达保持在较高水平，Realtime PCR半定量分析与以上结果吻合。结论：视神经横断后nestin在Müller细胞上的诱导表达是Müller细胞对视网膜损伤产生的一种反应，Nestin的表达量在一定时间内与病程进展相一致。Nestin在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达可能对视网膜神经节细胞具有保护作用。
【关键词】 视神经横断；Müller细胞；nestin
Nestin expression in Müller glial cells in rat retina following optic nerve transection
LiPing Xue,Peng Ding,KaiLi Wu,ChunGuang Jiang,ZhuLin Hu,LiBo Xiao, Hai Liu, EngAng Ling
Foundation item:Singapore Defence Science Organization Foundation(No.88036)
Department of Ophthalmology, Second Peoples Hospital of Yunnan Province, Kunming 650031, Yunnan Province, China;State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun YatSen University, Guangzhou 510060, Guangdong Province,China;Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650021, Yunnan Province, China;4Department of Anatomy, National University of Singapore, Singapore 117597
Abstract
AIM: To explore the expression of nestin in rat retina following optic nerve transection and its significance.
METHODS: Optic nerve transection mode was made to examined the reactive changes of Müller glial cells. Three rats were killed at each of the points at 1,3,7days postoperation for sagital sections. Double labeled immuno fluorescence was used to ascertain the cellular localization and the change of nestin in retina. Total RNA was extracted from the retina from the experimental and control rats for Realtime PCR analysis.
RESULTS: Nestinpositive staining was negligible in Müller glial cells of the adult rat retina.After 1 day, the Müller cells appeared induced nestin expression; After 3 days, nestin in Müller cells further enhanced; After 1 week, nestin in Müller cells remained at a relatively high level, Realtime PCR semiquantitative analysis with the above results.
CONCLUSION: Present results suggest that the induced expression of nestin in Müller glial cells is a reactive change in retinae subjected to optic nerve transection. The induced expression of nestin in Müller glial cells especially at their endfeet suggests a potential neuroprotective mechanism in neuronal degeneration.
KEYWORDS: optic nerve transection; Müller cell; nestin
0引言
视网膜属中枢神经系统（central nervous system,CNS）的一部分，哺乳动物中枢神经系统包括两种细胞：神经元和神经胶质细胞。Müller细胞是视网膜特有的一种神经胶质细胞，在视网膜各层之间构成精细的网状结构，维持视网膜的正常结构，营养神经元，参与构成血－视网膜屏障等多种功能，其足板与视网膜神经节细胞在解剖和功能上具有密切的关系。Müller细胞中含有大量的中间丝蛋白。Nestin（巢蛋白）属第六类中间丝蛋白，主要在神经干细胞/神经前体细胞上表达[13]，当神经干细胞分化成神经元或神经胶质细胞后，其表达下调并逐渐被其他特异性中间丝蛋白NF/GFAP代替[4]。因此，在中枢神经系统研究中，它被作为神经干细胞的标记物被广泛应用。我们的前期研究已经证明，大鼠生后视网膜中分化中和分化成熟的Müller细胞表达nestin，随视网膜日益成熟其表达逐渐减少，正常成年大鼠视网膜中几乎没有nestin表达。由此我们设计了本实验，制作视神经横断模型，探讨在视网膜神经节细胞急性大量死亡时nestin视网膜中的表达情况以及Müller细胞的反应，探讨是否如人们所推测Müller细胞就是一种特殊的神经前体细胞或者在特定情况下出现转分化，成为一种类似神经前体细胞的细胞。如果确实如此，意味着视网膜具有终生再生能力，这将对临床治疗一些疾病如晚期青光眼、视神经损伤等具有重要的意义。
1材料和方法
1.1材料 健康SD大鼠21只，雌雄不限（180～240g，2mo），购自新加坡国立大学实验动物中心。实验动物均排除眼部及全身疾病，所有实验操作方案遵循ARVO“眼科和视觉科学实验动物使用规范”。其中3只作为正常对照，18只制作视神经横断模型,操作中尽量减少动物痛苦及意外致动物死亡。
1.2方法 视神经横断动物模型制作：70g/L水合氯醛按350mg/kg的剂量腹腔麻醉大鼠，沿眶上缘做皮肤切口，向下翻转眼球，暴露视神经，沿纵轴剪开硬脑膜，在球后3mm处完全剪断视神经，注意勿损伤眼动脉，避免牵拉视神经。所有视神经切断点尽量有一个一致的定位。6 0尼龙线缝合皮下组织及皮肤切口。另1眼同样的操作仅暴露视神经后即关闭组织切口作为假手术组。所有大鼠均在右眼行视神经横断，左眼行假手术作为对照。大鼠眼球冰冻切片及免疫荧光染色:分别取术后1，3，7d大鼠，每组3只，腹腔麻醉后，40g/L的多聚甲醛灌注固定，迅速取眼球，40g/L多聚甲醛中4℃浸泡过夜，200g/L蔗糖4℃浸泡3～4h， OCT包埋，矢状位冰冻切片，片厚20μm，切取部位出现视神经后随机取6片,每片裱在明胶处理过的载玻片上，自然风干后置20℃冰箱保存备用。取各组切片0.01mol/L PBS洗3次，滴加正常羊血清室温1h，甩干，按照实验设计一抗为小鼠抗大鼠NeuN，兔抗大鼠GS/小鼠抗大鼠nestin，4℃过夜，各一抗浓度分别是GS（1∶1600），NeuN（1∶200），nestin（1∶200）。PBS洗3次，二抗是羊抗小鼠IgGCy3（1∶200）/羊抗兔IgGFITC（1∶200），室温暗盒中孵育1h，PBS洗3次，封片，共聚焦激光显微镜（Olympus FV1000）读片记录。Realtime PCR分析:分别取术后1，3，7d大鼠，每组3只过量水合氯醛处死大鼠，迅速取眼球置冰上，撕开眼球后剥出视网膜组织置小试管中迅速放入液氮中。按RNeasy Mini Kit (QIAGEN)说明抽提视网膜总RNA；抽提液在分光光度仪上定量及检测RNA纯度。A260/A280比值在1.6～2.1之间认为RNA纯度较高，可以作为逆转录反应模板。引物由Primer－Premier 5.0软件设计，并经NCBI BLAST向基因库检索验证，与其他基因无同源性，由TaKaYa生物公司合成。
基因引物序列片段长度
nestin 5CAACCACAGGAGTGGGAACT3220bp
5TCTGGCATTGACTGAGCAAC3
GFAP 5GAAGAAAACCGCATCACCAT3190bp
5GCACACCTCACATCACATCC3
将视网膜总RNA提取液按MMLVRT试剂盒要求行反转录反应，反应步骤如下：2μg RNA, 1μL OligodT primer,加RNasefree water定容至15μL， 70℃反应5min，反应结束后置冰上。配置反转录反应体系如下：5×MMLVRT Reaction Buffer 5μL, MMLVRT 1μL, RNase inhibitor 0.625μL,1.25μL dNTP，加RNasefree water至25μL，将上述混合物加于15μL RNA混合物中置42℃反应1h，反应结束后置20℃保存。Realtime PCR反应体系如下：5μL反转录产物，5μmol/L目的基因引物各1μL，5×反应混合物4μL，加水定容至20μL。95℃预热10min后，以95℃变性5s，61℃退火10s(nestin和GS)或60℃退火5s（GFAP），72℃延伸4s，反应35循环。RNA定量以Ct值表示，即PCR产物到达指数增长期的循环数,同时以样本中内对照GAPDH的量来标化,实验结果以相对于正常视网膜RNA量的2倍为有统计学显著性差异。
图1视神经横断后NeuN在视网膜中的表达（图A标尺为100μm，图B,C,D标尺为50μm）（略）
A：正常大鼠；B：术后1d；C：术后3d;D：术后1wk
图2视神经横断后视网膜神经节细胞计数（bP≤0.01）（略）
统计学分析: 应用配对t检验，SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，以P≤0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1视神经横断后神经节细胞计数 我们用NeuN来标记视网膜内侧RGC，参考Xue等[5]方法取视神经颞侧1mm处计数3个高倍镜下0.173mm长度中NeuN阳性细胞。正常大鼠RGC基数为16.24±2.68个（图1A），术后1d，RGC即出现显著减少（图1B），术后3d，RGC数量进一步减少（图1C），至术后1wk（图1D）。和对照组相比差异有显著性，术后1wk RGC只有假手术组RGC的40％左右（图2）。
2.2视神经横断后nestin表达情况 术后1d，nestin表达即有增加，主要呈栅栏状分布于GCL和IPL，位于内界膜的Müller细胞足板处nestin染色强，向INL方向染色强度减弱（图3 AC）。术后3d，nestin在Müller细胞上的表达进一步增强（图3DF）。术后1wk，nestin在Müller细胞上的表达保持在较高水平（图3GI）。所有nestin阳性细胞同时表达GS（图3 C,F,I）。GS标记的Müller细胞从术后1d到术后1wk数量上未见明显改变，但GS的表达位置则更集中于Müller细胞足板处（图3A,D,G）。
图3视神经横断后nestin在Müller细胞上的诱导表达（标尺为50μm）（略）
AC:术后1d，nestin表达有增加；DF：术后3d, nestin表达进一步增强；GI：术后1wk，nestin表达保持在较高水平
图4视神经横断后nestin mRNA Realtime PCR半定量分析结果（bP≤0.01）（略）
2.3视神经横断后nestin mRNA表达情况 Realtime PCR分析结果显示视神经横断后检测到220bp的nestin mRNA，术后表达呈上升趋势，术后1wk表达水平最高，各时间点实验组和对照组差异有显著性（图4）。
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