【摘要】 目的：探讨HSP60(热休克蛋白60)在大鼠急性青光眼模型视网膜组织中的表达及其与血清中相应抗体的关系。方法：将SD大鼠70只随机分为高眼压组60只，正常对照组10只 。大鼠全身及表面麻醉后，将一盛有等渗的生理盐水的储容器相连的7号针头于3∶00位的角膜缘处刺入前房，提升储容器的高度，使眼内压达到110mmHg,但不超过150mmHg,观察大鼠眼前段变白，且视网膜色白，未见红色反光时即为视网膜缺血，缺血1h后再灌注，并于再灌注后2,6,12,24,72,168h将大鼠麻醉过量致死，处死前测眼压,抽血2mL,供酶联免疫吸附测定使用,分析视网膜组织内HSP60抗原产生的血清中相应抗体水平。并立即取出眼球，同时对鼠眼视网膜组织进行石蜡切片,采用免疫组化法检测视网膜组织中HSP60的表达及分布情况,并对检测结果进行统计学分析。结果：急性高眼压诱导的视网膜缺血/再灌注组眼压明显升高,视网膜组织中的HSP60阳性表达率在术后各时间点,高眼压组与正常对照组比较,差异有统计学意义(F=97.21, 40.72, 83.85, 95.82, 48.63 及44.37,均P<0.01)。神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）中HSP60阳性表达随着眼压升高及高眼压持续时间延长逐渐增强,且视网膜神经纤维层中也出现较明显的HSP60阳性表达。结论：HSP60表达增强可能在急性高眼压所致的视神经病变中具有重要作用。
【关键词】 急性高眼压; 视网膜;HSP60; 酶联免疫吸附测定
HSP60 expression and function in rat model of acute high intraocular pressure in retinal tissue
Qian Sha, XiZhen Qiao, QingZhu Nie, ZhiBin Yao, YingShuang Wang, Wei Xiao, DianWen Gao
Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China;the Fourth Hospital of Heilongjiang Province, Harbin 150500, Heilongjiang Province, China;Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110032, Liaoning Province, China;Harbin Aier Eye Hospital, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China
Abstract
AIM: To investigate the HSP60 (heat shock protein 60) in the rat glaucoma model of acute retinal tissue and its relationship with the corresponding antibodies in serum.
METHODS: Seventy SD rats were randomly divided into hightension group 60 rats, the normal control group 10 rats. In Rats after general anesthesia, will be one of isotonic filled with a saline reservoir connected to the container on the 7th at 3:00 oclock needlepiercing department of limbal anterior chamber to enhance the high storage containers, so that the intraocular pressure to achieve 110mmHg, but no more than 150mmHg, To observe white rat anterior segment and retinal color white, not red when it is reflective of retinal ischemia, ischemic reperfusion 1 hour, and after reperfusion 2,6,12,24 hours; 3,7 days rats died of excessive anesthesia, put to death before the intraocular pressure measurement, blood 2mL, for enzymelinked immunosorbent assay, analysis of the retinal tissue HSP60 antigen produced in the corresponding serum antibody levels. And immediately took out its eyeballs, at the same time on rat retinal organizations paraffin sections using immunohistochemistry detection of retinal tissue HSP60 expression and distribution, and test results were statistically analyzed.
RESULTS: The acute ocular hypertension induced by retinal ischemia / reperfusion group were significantly increased intraocular pressure, retinal tissue at the rate of positive expression of HSP60 after each point in time, ocular hypertension group and control group, the differences were significance (F=97.21, 40.72, 83.85, 95.82, 48.63 and 44.37,P<0.01)). RGC as the positive expression of HSP60 in intraocular pressure and high pressure gradually extending the duration and retinal nerve fiber layer also appear more pronounced positive expression of HSP60.
CONCLUSION: HSP60 expression plays an important role in acute ocular hypertension. It may be caused by optic neuropathy.
KEYWORDS: acute high intraocular pressure; retina; HSP60; enzymelinked immunosorbent assay
0引言
青光眼是一组威胁视神经的视觉功能的一种常见眼病，目前认为其特征性的改变为眼压的升高引起视神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）的进行性死亡,而RGC损伤的确切发病机制尚不完全清楚，因而保护RGC和视神经免于继续受损已成为青光眼研究的重点与热点。近年来，国外研究认为HSP27在青光眼视神经损伤过程中可能起着细胞防卫作用[1]。对于HSP60的报道较少，我们制作了实验性高眼压动物模型，研究HSP60在视网膜上的表达，及其对于视神经损伤中的作用。
1材料和方法
1.1材料 选择健康SD大鼠70只(鼠龄为4～5wk) ,质量为220～300g,雄性，由中国医科大学动物实验中心提供。将实验大鼠随机分为2组:高眼压组60只、正常对照组10 只,用于该研究的6 个阶段。规定高眼压组右眼为实验眼。使用Zeiss眼科手术显微镜、显微剪、显微有齿镊、水下电凝器(美国博士伦公司) , 96孔显微滴定板(昆明友宁科技公司) ,各型Eppendorf管、全自动酶标仪(瑞士哈美顿公司) , Tonopen XL 眼压计(美国Mentor公司), AS325 型旋转石蜡切片机(英国Shandon公司) 。HSP60(美国Calbiochem 公司) ,HSP60单克隆抗体、即用型第2 代免疫组化ElivisionTM plus 试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发公司) ,牛血清白蛋白(北京元亨圣马生物技术研究所) ,山羊抗鼠IgG二抗(北京中山公司) 。
1.2方法 动物在安静、避免强光的环境中静养1wk。30g/L戊巴比妥钠按30mg/kg,ip麻醉。术眼滴贝诺喜眼液1滴,每5min 1次，共计3次，将一盛有等渗生理盐水的储容器相连的7号针头于3∶00位的角膜缘附近刺入前房，提升储容器的高度，使眼内压达到110mmHg,但不超过150mmHg,观察大鼠眼前段变白，且视网膜色白，未见红色反光时即为视网膜缺血，缺血1h后再灌注，并于再灌注后2,6,12,24,72,168h将大鼠麻醉过量致死，处死前测眼压。分别测定术前高眼压组、及正常对照组2组大鼠的双侧眼压以及术后2,6,12,24,72,168h高眼压组大鼠的双侧眼压。 用TonoPen XL 眼压计笔尖紧密接触角膜,记录每只眼5次眼压读数。笔尖刚接触角膜或刚离开角膜的任何读数因其不可靠均弃除。将每只眼的眼压读数均值作为眼压测定值。分别于术后2,6,12,24,72,168h处死高眼压组大鼠、正常对照组大鼠10只于术后1wk全部处死。以30g/L戊巴比妥钠按30mg/kg, ip麻醉显效后,剪开大鼠胸部皮肤及胸廓组织后,暴露心脏。先用5mL注射空针自右心室采血2mL,置入未抗凝的生化管中,按3000r/min离心5min ,吸取上清液约1mL,置入Eppendorf管后冻存于70℃冰箱中, 供酶联免疫吸附测定( enzymelinked immunosorbent assay, ELISA ) 使用。剪开左心室尖,插入供灌注用的自制专用9号灌注针头至升主动脉,止血钳夹闭主动脉并固定灌注针头,先用生理盐水100mL以40mL/min速度推注,再快速推注40g/L多聚甲醛约200mL, 防止RGC变性,直至大鼠全身僵硬。完整取出大鼠双侧眼球,分别放入事先已编号且盛有40g/L多聚甲醛的瓶中, 30min后用前房穿刺刀穿刺前房, 2h后将角膜、晶状体剔除(大鼠的玻璃体极少)制成眼杯,注意取出晶状体时尽量避免发生明显的视网膜脱离。再将眼杯置于同一瓶中,固定4～6h,取出眼杯后依次梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋供HE染色及免疫组化使用。沿视神经长轴尽量经过视神经行纵向剖切进行石蜡切片,切片厚度5μm。每一石蜡块取1张切片行HE常规染色。光学显微镜下观察大鼠眼球壁及视网膜各层组织结构情况。
表1高眼压组与正常对照组术前、术后眼压变化比较（略）
b P<0.01 vs高眼压组左眼及正常对照组眼压
1.2.1 EL ISA测定 用碳酸钠缓冲液pH值为8.8,将HSP60稀释为1g/L HSP60抗原溶液,包被96孔显微滴定板, 4℃孵育过夜。用10mL/L正常牛血清室温下阻断2h,再分别将高眼压组及正常对照组血清按1∶32稀释后,加入HSP60抗原包被板中,阴性对照未加一抗,阳性对照为用于免疫组化使用的HSP60单克隆一抗, 4℃孵育过夜。再加入1∶2000鼠抗人IgG室温下阻断2h,滴加新鲜配制的DAB液显色1h,在酶标板自动读数仪410nm处读数。血清抗体浓度以对照板中的吸光度(A)值获得的标准线性曲线(标准抗体倍比稀释后所获得的线性曲线)计算。
1.2.2免疫组化染色 石蜡切片常规脱蜡、水化,加30mL/L H2O2 室温下孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性。再加即用型HSP60 mAb一抗,阴性对照用PBS代替一抗, 37℃温育60min。加聚合物增强剂室温下孵育20min,加酶标抗鼠或兔聚合物,室温下孵育30min。加新鲜配制的DAB液显色3～10min,显微镜下控制显色时间,自来水充分冲洗,苏木素复染40s, 110mL/L盐酸乙醇分化2s,自来水冲洗返蓝15min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。HSP60阳性表达信号主要为细胞质呈棕黄色。40倍物镜下每张切片选取RGCs较均匀的视野5～8个,由2名检查者计数阳性及阴性细胞数,计算RGCs阳性率。
统计学分析:采用SPSS 12.10统计软件包。眼压和血清中HSP60抗体含量各组间比较,采用重复测量资料的方差分析;术前、术后各时间点间两两比较以及术后不同时间点的各组间两两比较,均采用多个样本均数的两两比较LSD 法; 高眼压组及正常对照组左、右眼在术后各时间点的RGCs阳性细胞率比较,采用χ2检验。以P<0.05作为差异有统计学意义。
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