【摘要】 目的：探讨视网膜神经细胞的体外培养方法。方法：取出生3d的SD大鼠视网膜组织，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶依次消化并吹打制成含不同大小细胞团块的细胞悬液，放入50mL/L CO2，37℃的孵箱中培养。用倒置相差显微镜观察视网膜神经细胞的生长情况。结果：聚集成小团的视网膜神经细胞(<50个细胞)与完全分离成单个的神经细胞相比,贴壁和发出轴突的时间早，轴突长度长，细胞间的轴突联系增多，细胞存活时间亦延长。而较大团块状的细胞只可以见到轴突的伸出和伸长。结论：小团样的视网膜神经细胞培养有利于神经细胞的存活和细胞间的轴突联系，这可能得益于视网膜多种细胞间的联系在体外的持续保持。
【关键词】 细胞培养;视网膜神经细胞;SD大鼠
Method of rat retinal neural cell culture
ZhaoHui Feng, ChunHua Li, YuPing Zheng, XiaoHua Wang, QuanChen Xiong
Foundation item:National Natural Science Foundation of China（No.30772598）
Department of Ophthalmology, the Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Xian Jiaotong University, Xian 710004, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM: To explore culture methods in vitro of rat retinal neural cell culture.
METHODS: Neural retina of postnatal 3 days SpragueDaw rats were digested by papain and trypsin in turn, and then gently percussed to loose adherent cells. Cell suspension with different sizes of cell aggregates were maintained at 37℃ in a humidified 50mL/L CO2 incubator. Cell growth was observed by phasecontrast microscope.
RESULTS: Compared with single dissociated cell, cells in small cell aggregates had more axonal connection and longer survival time, while cells in big cell aggregates only showed axonal growth.
CONCLUSION: Retinal neural cell culture is conducive to survival of nerve cells and cell contact between the axon, which may due to the continual remaining of intercellular connection in vitro.
KEYWORDS: cell culture; retinal neural cells; spraguedaw rats
0引言
视网膜神经细胞尤其是视网膜神经节细胞（RGC）的损伤，变性以及凋亡，可直接导致视功能的不可逆损害[1]。因此，体外培养视网膜神经细胞，明确视网膜神经细胞在正常生理和多种病理条件下的生长行为，是研究视网膜疾病发病机制和药物筛选的一个重要实验平台。视网膜神经细胞离体培养的方法有多种，在不同的培养方式中，神经细胞可能有不同的表现。我们对大鼠的视网膜神经细胞进行培养，发现即使是同一年龄的同一物种的细胞在相同培养条件下，视网膜神经细胞的分离程度不同，细胞的生长方式也有差异，现报道如下。
1材料和方法
1.1材料 SpragueDaw大鼠,生后3d以内的乳鼠, 由本校实验动物中心提供。DMEM/F12培养液（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone 公司），多聚赖氨酸（Sigma公司）。
1.2方法 取出生3d的 乳鼠浸泡于750mL/L乙醇中处死后,在无菌状态下挖出眼球,将眼球置入盛有无血清培养液的培养皿中,去除球周筋膜组织,在显微镜下以显微镊固定眼球，沿角膜缘剪下角膜，挤出晶状体和玻璃体，分离出视网膜组织，将分离到的视网膜组织收集于培养皿中，加入木瓜蛋白酶37℃进行消化10min,此时视网膜组织仍然呈片状，细心吸出蛋白酶液，保留视网膜组织片，并用无血清培养基漂洗一次后，加入1g/L胰蛋白酶继续消化10min，肉眼观察视网膜组织仍然呈片状，相差显微镜下观察，可以见到已有细胞从视网膜组织片中游离，轻轻吸出胰蛋白酶液，保留视网膜组织片，加入含200mL/L FBS的DMEM/F12培养基终止消化。用200μL移液枪轻轻吹打，经过两步酶消化的视网膜组织片立即松解，在相差显微镜下观察细胞吹打的程度，当细胞成为聚集成团的小团样时，停止吹打，接种于事先用5mg/L 多聚赖氨酸包被的24 孔培养板,入37℃二氧化碳培养箱培养。24h 后加入10μmol/L的阿糖胞苷以抑制非神经细胞的增殖, 阿糖胞苷作用24h后换液。其后每2d半量换液。
图1视网膜神经细胞接种24h后相差显微镜下观察(bar=20μm)（略）
A:24h分离成单个的细胞部分贴壁，胞体椭圆（细箭头），轴突较短（粗箭头）;B：从小细胞团游离的细胞贴壁数量多，轴突长
图2视网膜神经细胞接种4d相差显微镜下观察（略）
A:4d单个神经细胞的轴突伸长;B：小细胞团之间的轴突联系丰富
图3视网膜神经细胞接种7d相差显微镜下观察（略）
A：7d单个生长的神经细胞死亡，胞体变大，形态不规则，胞膜不清晰（细箭头），轴突变短（粗箭头）;B：小细胞团仍保持良好的生长状态；C:大细胞团块接种7d，从细胞团块中伸出轴突，但没有细胞游离贴壁
2结果
接种24h时,在相差显微镜下可见分离成单个的视网膜神经细胞有部分贴壁，贴壁后胞体形体略显椭圆，轴突较短，长度多在20μm以内（图1A）。与单个细胞相比，聚集成小团状的细胞贴壁细胞数目较多，伸出的轴突长（图1B），长度多<20μm；在接种后4d，视网膜神经细胞的生长明显，单个生长的神经细胞的轴突伸长（图2A），但是小神经细胞团的生长明显优于单个细胞的生长，从小神经细胞团中发出的轴突长，轴突之间的联系多（图2B）；接种后7d，单个生长的神经细胞开始死亡，细胞胞体变大，形态不规则，边缘不清，不易辨认，轴突亦变短（图3A）。小细胞团的生长仍然良好，与4d相比，轴突的长度仍有增长（图3B），这种生长现象可以持续到14d；在所培养的细胞中同时观察到大细胞团块的生长，当细胞团块过大，细胞数目在50个以上时，细胞之间的联系过度紧密，神经细胞无法游离贴壁，仅可以观察到细胞团块中伸出的神经细胞轴突的数量和长度。轴突生长的最高峰在7d（图3C）。
3讨论
目前有关视网膜神经细胞培养的报道较多，虽然在物种、年龄、培养方法上有一些差异，但归纳起来主要有3种：(1)视网膜组织块培养；(2)视网膜神经元细胞的纯化培养；(3)视网膜神经细胞混合培养。视网膜组织块培养通常是将完整的视网膜分为8块，在培养时对粘附底物的要求较高，在多聚赖氨酸的基础上还要添加层粘连蛋白和胶原，否则组织块易漂浮。组织块培养时通常只可见到极少量的细胞从组织团块边缘游离，这种培养的目的主要是观察神经节细胞轴突的伸展长度和方向[2,3]。视网膜神经元细胞的纯化培养包括对视网膜神经节细胞，双极细胞，感光细胞的纯化培养。常用的方法是免疫漂洗法，虽然操作繁琐，价格昂贵，但得到的细胞纯度高，实验结果的准确度高[4,5]。纯化细胞培养的缺点是在体外存活的时间太短，甚至不够一个疾病模型和药物周期的观察，这与视网膜神经元细胞在体外失去细胞之间的联系和支持有关，因此培养时外部微环境的人为调控和营养因子的添加非常重要，而这也有可能成为实验结果偏差的原因。视网膜神经细胞的混合培养是视网膜疾病药物研究中较常采用的方法。这种培养包括了视网膜内的多种细胞，虽然细胞成分不纯，但细胞数量多，存活时间长，有利于多种实验的进行和观察。视网膜神经细胞的混合培养通常是用胰酶将出生3d以内乳鼠的神经视网膜消化分离成单细胞悬液，然后接种培养[6]。由于胰酶的过度消化以及离心会损伤细胞的活性，我们在本次实验中采用了木瓜蛋白酶和胰酶的分步消化法。木瓜蛋白酶（papain）属巯基蛋白酶, 可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端, 并能优先水解那些在肽键的N端具有二个羧基的氨基酸或芳香L 氨基酸的肽键[7]。胰蛋白酶是一种能够破坏基质和粘附蛋白的蛋白水解酶[8]。这两种酶分步的短时间作用，使视网膜组织内的细胞连接变得疏松但细胞尚未完全游离时，轻轻吸除酶液，保留视网膜组织，轻柔吹打便可使细胞分散，因为酶液已经吸除，因而可省去离心步骤，减少因离心而带来的机械损伤。我们在本次实验中发现，在视网膜神经细胞的混合培养中，细胞的生长情况又随细胞分离的程度不同而有差异。当细胞完全分离为单个时，神经元细胞贴壁的时间和轴突生长的速度较慢，而当细胞聚集成小团（每团细胞数<50个）时，从小细胞团中游离出来的细胞活性好，贴壁细胞的数目多，时间早，轴突长度长，轴突之间的联系多，细胞的存活时间也延长。分析原因，这与细胞团块中细胞之间的相互联系得以保存有关。也就是说，在没有完全分离的小细胞团内部，保留了细胞在体内的联系方式，这种完全类似于体内的细胞间相互联系和支持有助于视网膜神经细胞的良好生长。但是当细胞团块过大（每团细胞数>50个）时，细胞之间的多重联系又会限制细胞的游离和生长，此时细胞的生长方式类似于视网膜组织块培养，只可见到轴突的伸出和伸长，而观察不到单个细胞的生长。
综上分析，我们认为在视网膜神经细胞的混合培养中，可以通过木瓜蛋白酶和胰酶的分步短时间消化，人为控制细胞的分离程度，来提高细胞的活性，并可以通过对细胞分离程度的控制，来选择针对不同实验目的的细胞培养方式。
【参考文献】
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3 Seigel GM. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis1999; 5:4
4尹小磊, 叶剑, 陈春林.新生SD大鼠视网膜神经节细胞体外原代培养.国际眼科杂志 2006；6(5)：10081010
5 Luo X, Heidinger V, Picaud S, et al. Selective excitotoxic degeneration of adult pig retinal ganglion cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci2001;42(5):1096 1106
6 Yoo MH, Lee JY, Lee SE, et al. Protection by pyruvate of rat retinal cells against zinc toxicity in vitro, and pressureinduced ischemia in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci2004;45(5):15231530
7沈悦.木瓜蛋白酶研究与应用综述.农林科学苑 2008；11(2):5153
8司徒梢强，吴军正.细胞培养.西安:世界图书出版公司1996:181182
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