【摘要】 目的：探索通过共焦激光眼底血管造影仪（HRA2）观测正常大鼠视网膜血管的形态和分布以及荧光标记的白细胞在眼底的运动情况的方法。方法：大鼠麻醉后散瞳并将其置于动物台上，荧光素钠血管造影观察大鼠视网膜血管的形态和分布，并照相和进行视频记录。另外，体外分离大鼠的外周血白细胞并用CFDA（6carboxyfluorescein diacetate）进行荧光标记，之后通过尾静脉将其回输进入同窝另一只大鼠的体内，观察白细胞在眼底血管的运动情况。结果：通过HRA2能够清楚而有效的观察到大鼠视网膜4级以上血管的形态和分布情况，并能够观察到白细胞在眼底血管中的各种运动状态。
结论：建立了一种通过HRA2观测大鼠视网膜血管及白细胞运动的方法。
【关键词】 微循环；眼底血管造影；大鼠；白细胞运动
The primary study of retinal microcirculation and leukocyte movement in rats
Qian Zhang, Feng Xia, Qun Guo, ZuoMing Zhang
Foundation item:National Nature Science Foundation of China(No. 30571999；30371517)
Department of Clinical Aerospace Medicine, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM: To explore a method of observing the morphous and distribution of ocular fundus blood vessels of rats and the leukocyte movement in the retinal vessels with HRA2.
METHODS: The rats were anesthetized and firmed on the stage, A low dose of 0.1mL 10g/L sodium fluorescein was injected intravenously to outline the retinal and choroidal vasculature, then, Normal and ConAactivated leukocytes were fluorescently labeled in vitro with 6carboxyfluorescein diacetate(CFDA) and rein fused
in vivo where they were tracked in the retinal and choroidal circulation of syngeneic rats by means of a Heidelberg retina angiograph 2(HRA2). Simultaneous digital and video images were captured for as long as 30 minutes.
RESULTS: We can clearly see the morphous and distribution of ocular fundus blood vessels of rats and the leukocyte movement in the ocular fundus with HRA2.
CONCLUSION: A technique to observe the morphous of the ocular fundus blood vessels and the movement of circulating leukocytes in vivo has been developed.
KEYWORDS: microcirculation; ocular fundus angiography; rats; leukocyte movement
0引言
白细胞渗出是炎症反应的最重要特征性。它是一个复杂的连续过程，包括白细胞的边集、附壁、黏附和游出等阶段，并在趋化因子的作用下运动到炎症灶，在局部发挥重要的防御作用。利用活体荧光显微镜能够在体观察到白细胞的渗出过程，从而能够对不同炎症或炎症不同阶段的特点有深入的了解，但是观察部位，如肠系膜[1]和软脑膜[2]等为一种有创观察，不利于长期的动态观察。眼底的微循环可以很直观的观察到，而且不会对被试造成损伤，另外，眼底微循环和大脑微循环非常相似，也可以作为研究大脑微循环的一个窗口。近年来，扫描激光检眼镜（scanning laser ophthalmoscopy, SLO）被应用于研究病理和生理条件下在体视网膜微循环内的白细胞动力学。Hossain等[3]利用共焦扫描激光检眼镜对大鼠进行在体的非侵入性白细胞示踪技术；Xu等[4]利用专门为小鼠定制的扫描激光检眼镜对小鼠进行在体的非侵入性白细胞示踪技术。Maass等[5]利用共焦激光眼底血管造影仪（HRA2）和扫描激光检眼镜（Zeiss confocal scanning laser ophthalmoscopy, cSLO）分别对小鼠凋亡的神经节细胞进行观察和照相，发现前者能够更有效而清楚的成像，特别是在荧光点的成像方面，HRA2表现出了明显的优势。但是该方法要求条件比较高，相关报道比较少。为深入探索视网膜疾病的发病机制，我们利用HRA2对正常大鼠眼底血管的形态和分布以及白细胞的运动情况进行观察和照相，建立了大鼠视网膜荧光血管造影和白细胞运动观察方法。
1材料和方法
1.1材料 选取4窝健康无眼疾的SD（Sprague Dawley）大鼠（第四军医大学航空航天临床医学教研室屏障动物实验室）40只，每窝10只，体质量200～300g；BN（Brown Norway）大鼠一窝6只，体质量180g左右，雌雄不分，室温环境下饲养，将SD大鼠其中的3窝分别随机分为2组，各5只，BN大鼠也随机分为2组，各3只，随机选其中一组用于心脏采血，另一组用于观察眼底血管及白细胞运动。第1窝（未分组的一窝）用于荧光素眼底血管造影以观察眼底血管的形态和分布；第2窝用于观察无ConA激活条件下白细胞在眼底血管中的运动情况。第3窝用于观察ConA激活条件下白细胞在眼底血管中的运动情况。第4窝和BN大鼠用于观察激光光凝术后眼底白细胞的运动情况。共焦激光眼底血管造影仪（HRA2）由德国海德堡工程公司生产。每窝大鼠的其中一组用于心脏采血约7～10mL，如果一只大鼠采不到足够的血量，可以一次采多只大鼠的血液，以期能够分离到足量的白细胞用于观察。分离液采用大鼠淋巴细胞分离液LTS 1083(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)。心脏采得新鲜抗凝血后立即与Hank’s液1∶1混匀，将混合液缓慢加入等体积的大鼠淋巴细胞分离液中，进行密度梯度离心，收集分离出来的白细胞，经细胞计数板计数，白细胞数约为1×109个/L血液，其中淋巴细胞约占60%～70%，单核细胞约占30%～40%。将所得细胞用Hank’s液离心漂洗3次以后再将这些细胞悬浮于RPMI 1640培养液5mL中，将其中一窝5只大鼠所分离出来的白细胞与CFDA[2]0.5mg共孵育30min 37℃，可见细胞悬液被染成金黄色，然后用Hank’s液反复离心漂洗3次，最后将所得细胞悬浮于RPMI 1640培养液1mL中以备用，经细胞计数板计数，白细胞数约为(5～7)×109个/L。另外一窝的5只大鼠用同样的方法分离淋巴细胞，为了激活这些细胞，将其悬浮于完全培养液[含2.5mg/L ConA(Sigma)] 10mL中，共孵育30min 37℃，之后再用RPMI 1640培养液离心漂洗3次，并以同样的方法用CFDA染色备用。
1.2方法
1.2.1眼底荧光素血管造影(FFA) 成年SD大鼠1只，0.7mL/kg速眠新注射液(军事医学科学院军事兽医研究所)ip麻醉，5g/L复方托吡卡胺滴眼液(北京双鹤现代医药技术有限责任公司产品)散瞳，将动物置于动物台上，调整台面高度使其与仪器相适应，将眼睛对准镜头，调试仪器开始观察眼底，等看到眼底时，立即尾静脉注射100g/L（原液浓度为200g/L，加入等体积的蒸馏水稀释至100g/L）荧光素钠注射液[6](广西梧州制药股份有限公司)0.5mL/kg，之后对一侧眼进行观察和照相。观察过程中每隔1～2min都要在双眼点泪然滴眼液（美国爱尔康公司），以防止角膜干燥。
1.2.2眼底白细胞运动的观察 将上述两窝的另外一组大鼠分别进行眼底观察照相。将其中一组5只大鼠分离得到的CFDA染色白细胞分别经尾静脉注入同窝另外5只大鼠体内，在此之前先尾静脉注射10g/L荧光素钠0.1mL以显示其血管的轮廓。HRA2下观察，照相。另外一窝经ConA激活的5只大鼠分离得到的CFDA染色白细胞分别经尾静脉注射进入同窝另外5只大鼠体内，同样的方法观察，照相。观察过程中每隔1～2min在双眼点泪然滴眼液。图象不清楚时，除了调整仪器之外，也要不断调整大鼠的被检测眼和镜头之间的位置关系。将最后一窝SD大鼠中的其中一组5只大鼠和BN大鼠的其中一组3只大鼠进行眼底激光光凝术，光斑能量为300mW（BN大鼠采用80mW的光斑能量）,分别在各个大鼠的鼻侧或颞侧密集地打52个点，以在裂隙灯下看到打激光处产生气泡为准，产生的光斑基本上为4级光斑。然后用上述同样的方法在光凝手术后2d和3d分别观察白细胞在眼底血管中的运动情况，结果与未打激光的大鼠无明显区别，看不到淋巴细胞在打激光区聚集黏附的现象，唯一的一点表现就是在打激光的地方可以看到稍强的背景荧光，而且是在脉络膜层比较明显。
2结果
2.1荧光素血管造影 本研究可以清楚地看到大鼠眼底血管的走向，分布和形态，正常大鼠眼底血管走行正常，无迂曲、渗出和出血等情况。最小可以看到4级血管。大鼠荧光素眼底血管造影由于血液循环短且速度快，很难和人眼底血管造影那样分为明显的动脉相、毛细血管相和静脉相，根据眼底血管的充盈和显像情况可以简单的分为早期相（荧光素注入后1min内，可以看到眼底1级血管的充盈和显像），中期相（荧光素注入后2～5min，可以看到视网膜的小血管，最小到4级血管都可以显像），后期相（荧光素注入5min以后，可以清楚地看到视网膜的血管显像和逐渐变亮的背景，后者是由于脉络膜血管荧光素渗漏所致）（图1）。BN大鼠由于眼底有色素，荧光素造影显像更清楚，而且拍摄时间更长，在荧光素注入后2h仍然能够清晰地看到眼底血管的走行和轮廓。
2.2眼底白细胞运动 HRA2能够在正常大鼠眼底观察到运动中的白细胞，ConA激活组的白细胞在视野中更多也更容易观察到，而且它们在血管中运动速度相对较慢，表现为同样的时间内视野中可以看到更多的白细胞，部分白细胞在视野中停留的时间更长。而正常组白细胞在眼底血管中的运动速度很快，有些运动速度很快的白细胞在视野中一闪而过，视野中的白细胞数量也相对较少。还有一些在组织中或小血管中的白细胞运动速度比较慢，可以清楚的看到白细胞运动的轨迹，另外还可以看到白细胞的黏附，跨膜和滚动（图2）。最后激光光凝组与对照组无明显区别，唯一可以观察到的就是激光光凝区可以看到稍多的脉络膜荧光渗漏（图3）。
3讨论
HRA2是近年来使用比较广泛的一种眼底血管成像仪，在临床上已经得到了广泛的应用。但是由于大鼠的眼睛包含一个相对大的晶状体和一个小的轴距以及扩大的瞳孔导致成像质量的减弱，产生球面像差；麻醉后角膜易混浊等因素的影响导致大鼠眼底造影的照片分辨率不高，清晰程度有限[7]，为此我们做了大量的尝试性工作。大鼠麻醉后在盖玻片表面滴1～2滴泪然滴眼液轻轻压迫大鼠眼球，暂时性减小角膜曲率，并且迅速进行实验，实验过程中每隔2min点泪然滴眼液以保持角膜透明，尽管如此，麻醉后30min角膜已经开始混浊导致图象模糊，所以一定要尽快进行观察和照相。ConA激活组的白细胞在血管中的运动速度相对于正常组较慢，在我们的实验中表现出更易于发生黏附，而且在视野中更容易观察到，可能于ConA促进了白细胞表面黏附因子LFA1等[8,9]的表达，使其与血管内皮细胞表面的ICAM1结合增多，从而能够更有效的黏附和跨膜；另外白细胞经ConA激活后由于表面黏附分子的影响，将会从轴流进入层流，从而也会减慢运动速度。在体观察视网膜微循环中白细胞的运动、游走情况将为在器官水平上研究炎症的发生和发展提供重要的方法学指导意义，并为研究大脑微循环提供重要的依据。为验证体外标记的白细胞是否能够直接参与到体内的炎症过程，我们采用激光光凝的方法造成视网膜不同程度的灼伤，再采用淋巴细胞标记的方法进行观察。但是在本实验条件下，我们没有发现激光损伤区域有明显的淋巴细胞黏附和渗出，其原因尚不清楚。Xu等[10]通过皮下注射人IRBP（感光细胞间维生素A类结合蛋白）肽建立实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎症模型，可以在小鼠眼底观察到标记的淋巴细胞参与炎症的明显过程，而本实验所造成的炎症为局部光化学灼伤，损伤范围局限，炎症反应相对较轻，而观察时间有限，因此没有记录到体外标记的白细胞直接参与到体内炎症的过程。
图1大鼠眼底荧光素血管造影照片（略）
A：SD大鼠早期；B：SD大鼠中期；C：SD大鼠后期；D：BN大鼠早期；E：BN大鼠中期；F：BN大鼠后期
图2眼底微血管中一个conA激活的白细胞黏附、滚动、游走的过程（箭头）。每张图片间隔时间为110ms （略）
A：4min 09s 340ms; B:4min 09s 45ms; C: 4min 09s 560ms; D:4min 09s 67ms;E:4min 09s 780ms;F：运动很快;G：静脉血管;H：动脉血管
图3激光光凝组BN大鼠荧光素眼底造影（略）
A:2min 43s;B: 9min 18s;C:15min 37s
综上所述，尽管小动物的眼底荧光素血管造影图象的精度和清晰度方面还存在着很多没有规范化的困难，但是在我们的尝试和调节下，HRA2仍然能够较理想的采集到小动物的眼底荧光素血管造影照片，并且能够在体实时的观察到白细胞在眼底血管中的运动情况，包括白细胞的边集、附壁和黏附等阶段，为研究炎症的病理机制以及眼底疾病的发生发展情况提供了很好的平台。
【参考文献】
1 姜勇,刘爱华,赵克森.大鼠肠系膜微循环白细胞流动分布的研究.中国病理生理杂志1998;14(4):347350
2张钢,高钰琪,刘福玉.缺氧对大鼠软脑膜微循环白细胞流变特性的影响.微循环学杂志2007;17(4):2022
3 Hossain P, Liversidge J, Cree MJ, et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci1998;39(10):18791887
4 Xu HP, Manivannan A, Goatman KA, et al. Improved leukocyte tracking in mouse retinal and choroidal circulation. Exp Eye Res 2002;74(3):403 410
5 Maass A, von Leithner PL, Luong V, et al. Assessment of rat and mouse RGC apoptosis imaging In vivo with different scanning laser ophthalmoscopes. Curr Eye Res2007;32(10):851 861
6 Mesri M, Liversidge J, Forrester JV. ICAMl/LFA1 interactions in Tlymphocyte activation and adhesion to cells of the bloodretina barrier in the rat. Immunology1994;83:5257
7 Zambarakji HJ, Keegan DJ, Holmes TM, et al. High resolution imaging of fluorescein patterns in RCS rat retinae and their direct correlation with histology. Exp Eye Res2006;82(1):164171
8 Devine L, lightman SL, Greenwood J. Role of LFA1, ICAM1, VLA4,and VCAM1 in lymphocyte migration across retinal pigment epithelial monolayers In vivo. Immunology1996;88(3):456 462
9 Saton T, Yamaguchi K. Ocular fundus abnormalities detected by fluorescein and indocyanine green angiography in the Royal College of Surgeons dystrophic rat. Exp Anim2001;49(4):275280
10 Xu HP, Manivannan A, Daniels G, et al. Evaluation of leukocyte dynamics in mouse retinal circulation with scanning laser ophthalmoloscopy. Br J Ophthalmol2001;85:765 890
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