【摘要】 目的：探讨利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增棘阿米巴18S rDNA在角膜炎早期临床诊断应用中的可行性。方法：以18S rDNA为模板，利用特异性引物JDP1JDP2配合PCR技术来检测临床标本中的棘阿米巴原虫。结果：在临床拟诊为棘阿米巴角膜炎的16例(16眼)中，通过PCR检测法有12眼证实为棘阿米巴原虫感染，同时100g/L KOH角膜刮片后镜检有5例发现了棘阿米巴包囊。两种诊断方法用Fisher确切概率法统计，P<0.05。结论：18S rDNA PCR技术对正确诊断早期棘阿米巴角膜炎有重要的临床应用价值。
【关键词】 18S rDNA PCR技术 棘阿米巴角膜炎 诊断
0引言
棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba keratitis, AK)是棘阿巴米巴感染人体引起的一种顽固的进行性角膜炎、角膜溃疡疾病。该病病情险恶,国内外学者特别强调早期诊断的重要性。其传统的诊断方法主要是角膜刮片，培养。其阳性率与取材部位，及观察者主观因素密切相关，且棘阿米巴形态多变、培养需时较长（15d左右）。国内外专家逐渐倾向于探求临床上使用可靠，敏感的研究系统。许多研究已经证实聚合链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在研究棘阿米巴是非常有用的[13]。1～10个滋养体都能够被检测出来[4,5]。18S rDNA DF3段以其特异性可提供棘阿米巴的分类[6]，本实验以利用其特异性做实验性的临床应用。
1材料和方法
1.1材料 琼脂粉，Nacl，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，Na2HpO4，K2HPO4，100g/L KOH，裂解液DTT；UNIQ10细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物科技有限公司）；PCR反应一体化（上海鼎新生物科技有限公司）；JDP1JDP2引物（上海生工生物科技有限公司）；JDP1：5′GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA3′；JDP2 : 5′TCTCACAA GCTGCTAGGGGAGTCA3′；Marker100～1000bp实验对照株：来源于北京市眼科研究所；埃希大肠杆菌、葡萄球菌、茄病菌：来源福建医科大学附属第一医院微生物室；正常人角膜基质细胞：来源于福建医科大学附属第一医院眼科角膜移植供体。本研究临床标本来自200707/200810福建医科大学附属第一医院眼科拟诊棘阿米巴角膜炎的16例(16眼)患者。临床表现主要是患眼剧烈疼痛，角膜有假树枝状或者环形基质灰白色浸润灶，无或少许分泌物，病程均在1wk～1mo以上，或临床使用各种抗细菌及真菌药物均无效，需排除棘阿米巴角膜炎。在采集标本时，16眼均先予患眼点10g/L丁卡因表面充分麻醉后，用手术刀片在浸润环或溃疡灶与正常角膜交界处刮取上皮至基质层，第1次取样置于加了1mL无菌蒸馏水的EP管中，送检做PCR检测，第2次取样用于100g/L KOH封片做镜检。3次取材置于加了活大肠杆菌的NNA琼脂培养基培养。以培养作为金标准。
图1 角膜刮取物NNA培养基培养15d后（略）
A：棘阿米巴胞囊（类圆形）×400；B：滋养体（不规则形状，其间偏位亮点是细胞核）×200
图2 角膜刮片100g/L KOH湿封片镜检（亚甲蓝染色×400） （略）
A：病例A2棘阿米巴胞囊；B，C：均为折光性很强的双壁胞囊，外囊壁呈皱缩状,内囊壁呈波浪状
1.2方法
1.2.1配置NNA培养基 琼脂粉15g，NaCl 120mg，MgSO4·7H2O 4mg，CaCl2·2H2O 4mg，Na2HPO4 142mg，K2HPO4136mg，H2O 1000mL，120℃高压20min。
1.2.2棘阿米巴DNA组提取 离心含有样本的EP管1300r/min，离心3min，弃掉蒸馏水，在其中加入0.5μL裂解液，混匀。再利用UNIQ10细菌基因组DNA抽提试剂盒提取样本DNA基因组。
1.3.3 PCR反应 循环体系：25μL，不足的用水填补，hot start体系12.5μL，JDP1 0.5μL，JDP2 0.5μL，模板10μL。PCR循环参数：94℃预变性3min，94℃变性60s，52℃退火60s，72℃延伸2.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
1.2.4 PCR扩增产物检测 取5μL棘阿米巴的18S rDNA基因扩增产物以1∶5体积比的6×电泳上样缓冲液混合，加入到含5g/L的溴乙锭的15g/L 琼脂凝胶上样孔。加入Marker、葡萄球菌、茄病菌、正常人角膜、实验对照虫株PCR产物，直流电100V电泳35min，紫外灯下观察结果并拍照。
1.2.5角膜刮片镜检 用角膜刮片刀取样后，直接涂抹于滴1滴100g/L KOH的载玻片上，涂抹均匀，盖玻片封片。光学显微镜镜检。
2结果
2.1 NNA培养结果 14例角膜炎患者培养阳性，培养3d左右，倒置显微镜可以看见接种部位阿米巴胞囊转为滋养体，高倍镜下可以观察到其内有颗粒状内质在流动，泛粉色的核，透明的棘，变化不定的外质。7d可看见滋养体离开接种部位向周边移动，接种点附近胞囊形成，包囊大部分呈类圆球形,双层囊壁,外层透明，内层呈星状或多角形。15d左右可见远离接种点有滋养体活动，及胞囊(图1)。
2.2角膜刮片100g/L KOH封片镜检 角膜刮片，滋养体在KOH刺激下变成胞囊，而其他细胞被破坏。1次刮片4例检查结果阳性，行2次刮片观察到5例阳性(图2) 。
2.3 PCR结果 利用JDP1JDP2引物扩增18S rDNA产物，约450bp左右，12例阳性；与来源于北京市眼科研究所实验对照株扩增出的片段大小基本一致。有12例阳性；葡萄球菌，正常人角膜基质细胞，茄病箘均无阳性条带（图3）。
统计学分析：利用Fisher确切概率法统计分析（表1）。利用PCR，JDP1JDP2引物扩增16个病例，其中12例被证实阳性，片段大约在460～470bp大小，本实验的另一篇文章将会详细报道棘阿米巴的基因分型。病例16获得的片段在423～460bp大小左右。两种诊断方法用Fisher确切概率法统计，P<0.05；有统计学意义。PCR技术能更准确诊断AK。进行PCR反应的16例标本均为新鲜样本，其内大部分为胞囊，偶尔可见滋养体。PCR产物从9例培养阳性（65%），1例培养阴性病例中获得，这样看来PCR技术与培养有56%的几率一致。如果把PCR阳性，培养阴性的病例（病例5）计入，PCR技术更能提供临床诊断信息到61%。另外PCR阴性的病例8，9b，13，但角膜刮片镜检中阳性；联合PCR技术和刮片镜检方法可提高棘阿米巴性角膜炎诊断率83.3%。图3 PCR扩增产物凝胶电泳成像分析 A：阳性病例与葡萄球菌（Sta），正常人角膜基质细胞（H），茄病箘（Bg）对照；B：实验对照株（ESC）的阳性条带；M：Marke
表1 棘阿米巴实验室检查结果阳性率比较（略）
表2 棘阿米巴实验室检查结果对比表（略）
注：a：同一病例第一次取材；b：同一病例同一眼第二次取材；c：就诊前抗棘阿米巴治疗过的病例
3讨论
3.1 JDP1JDP2引物扩增种属诊断特异性 棘阿米巴属18S rDNA基因型描述的首要研究就是有效的配对引物的设计。首次利用PCR技术检测棘阿米巴属基因特异性诊断的是Vodkin等[7]。这些作者使用ACARNA13831655引物，扩增1383～1655bp之间的片段，证明即使棘阿米巴虫株很少，许多的基因条带也能获得相应的PCR产物，新鲜的样本，被福尔马林浸泡过的样本也可以获得。之后Lehmann等[3]证实这对引物也能用于诊断棘阿米巴角膜炎。一些作者随后发现了与18S rDNA有关的第2对引物PIGP23792632，能扩增1835～2079bp之间的片段，在临床研究中，能诊断棘阿米巴的存在。最新的相近的只有16bp大小的扩增引物已经应用于临床[8]。18S rDNA基因序列数据库已经被用于设计种属特异性诊断的引物，可以只扩增棘阿米巴属的18S rDNA基因型，不会扩增其他相近的阿米巴种属或者其他有机体包括人类的基因序列，这个目标从引物JDP1JDP2中实现。Schroeder等[9]已经证明此引物在每一个阿米巴种属中均可获得扩增条带。目前为止，JDP1JDP2扩增引物因为其基因高选择性及可以从所有18S rDNA获得扩增条带而成为特异性诊断棘阿米巴的最好的选择。这使得它对棘阿米巴成分复杂的环境样本有独特的作用。本实验以葡萄球菌，正常人角膜基质细胞，茄病箘均无阳性条带从部分方面证明这个引物的种属特异性。一方面又排除其他角膜炎的可能。
3.2 PCR技术的敏感性 Vodkin等[7]能利用PCR从单个滋养体中扩增出相应的基因产物。我们将提取的40μL DNA样品分4管，全部参加PCR反应，保证平均1～2个滋养体可获得ASA.S1产物，这个敏感性已经在16个病例中被证实，包括部分刮片、培养为阴性的病例(表2)。我们明确知道细胞克隆能从单个胞囊和滋养体中获得，同样我们已经知道单个滋养体足够PCR反应。但以我们目前的技术和知识水平尚未在成熟的棘阿米巴胞囊中获得基因扩增产物。A3a，A9a培养和刮片阴性的病例中PCR结果阳性，而A3b，A9b，A12，A15均为治疗过的，培养阳性，PCR结果阴性，推测经治疗后棘阿米巴可能因环境变化，形成成熟的胞囊，目前的实验结果表明PCR成功的关键是样本中含有滋养体和未成熟的胞囊，而培养阳性PCR阴性的样本中只含有成熟的胞囊。来就诊病例最短1wk，角膜刮片镜检结果只有5例明确诊断为阳性。分析原因可能由于这时角膜上皮损害较小，刮片部位太浅，未刮到原虫有关[10]。另外当混合真菌感染时，100g/L KOH并不能破坏真菌的孢子，再加上对棘阿米巴形态认识不够，很容易漏诊。而PCR技术则可以完全排除主观因素，早期明确诊断。
3.3 PCR技术其他优点 由于PCR 的种属诊断特异性、JDP1JDP2引物扩增的敏感性强，所以只需极少量标本，就可获得阳性结果。Hot start体系减少了多次加样的麻烦，对于多样本操作时减少了错误出现。加上目前采用电脑调控的DNA 扩增仪，只需一次性把整个反应系统配置好，输入正确程序，便可自动进行变性、复性、延伸3个反应阶段，产生正确的PCR产物。所以整个操作非常简便、迅速。为临床快速诊断提供了有效手段[11]。
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