角膜结膜及泪器病             1634                                      PO0274

　　RNA干扰p27kip1对牛角膜内皮细胞增殖的影响

　　黄渝侃1  张明昌1  王勇2  范可顺1  张光红1

　　武汉 华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科教研室  430022

　　目的：了解是否p27kip1的RNA干扰作用能克服牛角膜内皮细胞的G1期阻滞并促进细胞周期进展。

　　方法：设计并生物合成针对p27kip1的siRNA寡核苷酸，构建表达载体p27Kip11，p27Kip12，p27Kip13。培养的牛角膜内皮细胞使用脂质体对三条质粒行瞬时转染，设计空白质粒及空白对照组，均孵育4、12、24、48小时。在各时间点收取各组细胞分别行RT-PCR检测p27kip1的mRNA含量，行蛋白质印迹法（Western blot）检测RNA干扰对牛角膜内皮细胞p27kip1蛋白水平影响，培养物爬片固定并行p27kip1免疫染色以检验下调，使用流式细胞测量分析细胞周期，甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细RNA干扰p27kip1对胞增殖功能及DNA合成的影响。

　　结果： 4、12小时RT-PCR、Western blot、MTT、流式细胞周期检测及免疫组化染色检测与空白对照组及空白质粒组无显著性差异。24、48小时RT-PCR检测p27kip1的mRNA含量，p27kip1蛋白水平与4、12小时组、空白对照组及空白质粒组比较显著下调，MTT法检测OD值随时间推移提高，对细胞增殖有明显促进作用，流式细胞周期检测提示比较对照组G0/G1期细胞百分比明显降低，S期及G2/M百分比增高。

　　结论：RNA干扰p27kip1使培养的牛角膜内皮细胞p27kip1的mRNA及蛋白水平下调，促进其细胞增殖。

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