作者：熊欣，彭琦，郑燕林
作者单位：610072)中国四川省成都市，成都中医药大学；(610072)中国四川省成都市，成都中医药大学附属医院眼科
【摘要】 目的：研究水蛭提取物对凝血酶诱导的RF6A细胞（恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞）跨膜受体VEGFR2表达的影响，从而探讨中药水蛭用于防治新生血管形成中的作用。方法：将培养细胞分成水蛭组，凝血酶组，凝血酶＋水蛭组及空白组。在前期实验基础上选择64g/L水蛭提取液及20NIHU/mL凝血酶。8h后，采用免疫组织化的方法检测各组细胞VEGFR2的表达，并进行图像分析。结果：免疫组化分析：与空白组比较水蛭组RF 6A细胞膜上VEGFR2的表达明显降低，降低程度高于凝血酶组，小于混合组，Sig＝0.000，P<0.01各组间的差异有统计学意义。结论：水蛭提取物可使内皮细胞跨膜受体VEGFR2表达明显减少，推测其对VEGF受体介导的跨膜信号传导途径的作用可能是通过竞争性地抑制VEGF与其受体的结合。
【关键词】 水蛭提取物;RF 6A细胞;凝血酶;VEGFR2;免疫组化
Effect of the leech extracts from percolation on the expression of transmembrane receptor VEGFR2 of RF6A cells
Xin Xiong, Qi Peng, YanLin Zheng
Foundation item:Doctoral Startup Foundation of China（No.20050633003）
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan Province, China; Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu 610072, Sichuan Province, China
Abstract AIM: To study the effect of the leech extracts from percolation on the expression of transmembrane receptor VEGFR2 of RF6A cells (rhesus monkey retinal vascular endothelial cells) in vitro, and to infer its role on preventing the newborn blood vessel. METHODS: The culture cells were divided into four groups: leech group, thrombin group, thrombin + leech group, and blank control group. Based on the previous experiments, 64g/L leech extracts and 20NIHU/mL thrombin were chosen. After 8 hours, the expression of VEGFR2 on each group of cells were examined using immunohistochemistry method, and then did image analysis. RESULTS: The image analysis of immunohistochemistry showed that in leech group, the expression of VEGFR2 on the RF6A cells membrane reduced obviously compared with blank control group. The reduction was higher than that of thrombin group but lower than mixed group (Sig＝0.000), the differences of each group had statistical significance (P<0.01). CONCLUSION: The leech extracts can cause the obvious reduction of endothelial cells transmembrane receptor VEGFR2, which suggests that the role of the leech extracts on the transmembrane signal transmission including by VEGF may be through competitive inhibit the combination of VEGF and its receptor.
KEYWORDS:leech extracts; RF6A cells; thrombin; VEGFR2; immunohistochemistry
新生血管可以在眼的角膜，虹膜，脉络膜，视网膜等组织中形成，涉及眼的前后节众多疾病，由于新生血管内皮细胞间的结构异常，管壁容易渗漏及出血，且周围伴有结缔组织的增生，这些病理改变严重影响眼的结构和功能，对视力构成极大威胁。目前眼科领域新生血管相关的研究已受到人们的重视，特别是血管形成抑制剂及其作用机制更是研究的热点。本研究通过体外细胞实验探讨水蛭提取液对RF 6A细胞跨膜受体VEGFR2的影响，推断其作用机制，探寻水蛭在预防新生血管形成中的作用。
1材料和方法
1.1材料 RF 6A恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞，细胞号TRL1GNO2，由中国科学院上海细胞库提供。
1.2方法
1.2.1水蛭提取液的制备 选用宽体金线蛭，符合2005版《中华人民共和国药典》一部“水蛭”项下有关规定。取水蛭粗粉31.5g加750g/L乙醇200mL，使均匀润湿，加盖，放置2h，装入渗滤筒中，添加750mL/L乙醇高出药面3cm,排出筒内空气，加盖放置48h后放出药液，流速3mL/min,并从药面不断添加750mL/L乙醇5000mL，渗滤液回收乙醇至无醇味，定容至50mL。每毫升相当于原生药0.63g。每克原生药含总氮量为8mg，水蛭素的含量为5.61ATU/g。药液经60Co照射灭菌，备用。使用前以正压式针芯滤器（φ0.45μm）过滤除菌。
1.2.2细胞培养及实验分组 购买RF/6A细胞株传代培养。细胞计数后按2×104密度接种到新培养瓶中。待细胞汇合80％以上，成典型铺路石样外观，接触抑制后再次细胞计数，传代培养。国内外大多学者认为Ⅷ因子相关抗原对内皮细胞鉴定有特异性且方法简单[1,2]，传代3次后细胞状态稳定， Ⅷ因子相关抗原显示阳性，确认为内皮细胞后即用于实验。根据处理因素的不同将细胞分为水蛭组，水蛭加凝血酶组，凝血酶组和空白对照组。在前期实验的基础上，选择64g/L水蛭提取液及20NIHU/mL凝血酶作为诱导浓度。
1.2.3 VEGRFR2（FLK1）免疫组织化学检测 采用细胞爬片技术分别收集各组细胞，每组5张细胞片。兔抗人多克隆抗体工作液浓度1∶100稀释，过氧化物酶标记链霉卵白素染色（SP法）进行免疫组化染色，具体步骤按试剂说明书进行。显色后细胞爬片照相，送图象分析软件分析。
统计学分析:经图象分析软件分析得光密度值和灰度值，采用SPSS 13.0统计软件包采用单因素方差分析方法分析处理。并选用Dunnett法和LSD法进行多重比较。检验水准α＝0.01。
2结果
2.1 RF 6A细胞鉴定结果 倒置显微镜下观察到两种形态的内皮细胞，一种体积较小，呈短梭形，胞浆反光强，数量较少。另一种细胞体积较大，呈多角形，胞浆丰富，有一个至数个核仁，数量较多，呈“铺路石样”。Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色呈阳性，棕黄色颗粒均匀分布在整个胞质，结合细胞形态特征，可判定此种细胞为视网膜脉络膜血管内皮细胞。
2.2水蛭提取物对VEGFR2表达的影响 空白对照组可见VEGFR2较高水平的表达，染色深棕色，苏木精复染为紫色主要表达在细胞膜上，在胞质中也有少量表达。凝血酶组表达降低，可见细胞膜上较少量表达。水蛭提取物组及混合组表达明显降低，只在细胞膜上有极少量表达。图像送分析软件分析后结果如表1。
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