作者：徐琼，黄晓峰,魏小燕，武明媚，丁国鹏，李耀宇
作者单位：100083)中国北京市,中国人民解放军总医院军医进修学院；(710032)中国陕西省西安市,第四军医大学基础部电镜中心;(710032)中国陕西省西安市,第四军医大学神经科学研究所;(030001)中国山西省太原市,山西医科大学;(100700)中国北京市，北京军区总医院眼科
【摘要】 目的：电镜下观察正常成年大鼠视网膜中脑红蛋白（Ngb）的表达。方法：用电镜免疫金银细胞化学法研究Ngb在成年大鼠视网膜中的亚细胞定位。结果：Ngb在视网膜除外核层和视锥视杆层的外节段以外的其它各层均有分布。在细胞层Ngb定位于细胞的胞质内，线粒体周围多见，内质网和高尔基复合体的管腔外侧也可见Ngb阳性着色；在丛状层Ngb分布于突触前成分的突触小泡之间。结论：Ngb的特殊亚细胞分布提示其与神经元供氧的紧密关系。
【关键词】 脑红蛋白；视网膜；超微结构；免疫金银染色；大鼠
Ultrastructural study of intraretinal distribution of neuroglobin proteins in normal adult rats
Qiong Xu, XiaoFeng Huang, XiaoYan Wei, MingMei Wu, GuoPeng Ding, YaoYu Li
Foundation item:National Natural Science Foundation of China(No.30471856)
PLA Postgraduate Medical School, Beijing 100083, China; FMMU Electronic Microscope Center, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China; Institute of Neurosciences, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China; Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,Shanxi Province,China;Department of Ophthalmology, General Hospital of Beijing Military Command of Chinese PLA, Beijing 100700, China
Abstract AIM: To investigate the intraretinal expression of neuroglobin (Ngb) in normal adult rats.METHODS: Four normal female adult SpragueDawdey rats were used, and the ultrastructural location of expressed Ngb in the retina was determined by immunogoldsilver staining. RESULTS: Ngb was distributed at each layer expext for outer nuclear layer and outer segment of rods and cones layer. Stained Ngb proteins were detected in the ganglion cell, internal plexiform, inner nuclea, outer plexiform, photoreceptor inner segment and the retinal pigment epithelium layers. In the cells, Ngb immunoreactivity presented in the cytoplasm, mainly around the mitochondria and outside the cisterna of rough endoplasmic reticulum and Golgi complex. It was also found between the synaptic vesicles. CONCLUSION: The special ultrastructural location of expressed Ngb in retina suggests a close relationship between Ngb and oxygen supply in neurons.
KEYWORDS:neuroglobin;retina;ultastructure;immunogold silver staining; rat
Burmester等[1] 于2000年发现脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）。Ngb是一种呼吸蛋白，与血红蛋白（hemoglobin, Hb）和肌红蛋白（myoglobin，Mb）同属血红素类球蛋白家族，可通过分子内部的铁卟啉环与氧进行可逆性的结合，参与氧的转运与储存[2]。Ngb主要分布于脊椎动物的脑和视网膜中[1]，在周围神经系统和内分泌组织中也有一定的表达[3]。Ngb在小鼠视网膜中的浓度大约为50～100μmol/L，相当于脑中浓度的100倍[3]。此浓度与肌细胞中的Mb浓度在同一范围内，由此推测，与Mb在肌组织中的作用相似，Ngb在神经组织中也有相应的供氧功能。研究Ngb的具体亚细胞定位，将有助于探讨其参与氧代谢的具体环节，进一步验证其可能的生理功能，同时也能为临床研究循环障碍性疾病的治疗提供一个新思路。因此我们采用免疫电镜方法，观察了成年大鼠视网膜内Ngb的亚细胞分布。
1材料和方法
1.1材料 成年雌性SpragueDawley清洁级大鼠4只购自第四军医大学实验动物中心，体质量220～250g。外眼正常，检眼镜查屈光介质清晰，眼底未见异常。
1.2方法 组织处理：10g/L戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉大鼠后，升主动脉插管，快速灌注生理盐水100mL，再灌注0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4，内含40g/L多聚甲醛、0.5g/L戊二醛和150g/L饱和苦味酸）500mL。灌毕立即剜出双侧眼球，去除眼前节，置入不含戊二醛的固定液中后固定2h。行冠状位振动切片，厚200μm，放入含300g/L蔗糖的PBS中浸泡1h。经液氮冻融处理后，含50g/L牛血清白蛋白和50mL/L正常羊血清封闭液室温下封闭3h。经0.01mol/L PBS清洗后，加入兔抗Ngb抗体（Sigma公司，1∶800），室温下孵育24h，抗体稀释液用含10g/L牛血清白蛋白和10mL/L正常羊血清的PBS配制。PBS清洗后，加入1.4nm金标记的抗兔IgG（1∶150，Nanoprobes），4℃孵育12h，经PBS清洗后，20mL/L戊二醛固定45min，去离子水洗4～5次，用银加强试剂盒做银加强反应，室温下避光放置8～10min。反应结束后去离子水清洗，0.1mol/L的PB清洗4～5次，入5g/L锇酸中后固定1h，经梯度乙醇和丙酮脱水后，Embed 812（Electromicro Science）浸透，平板包埋，聚合后在光镜下选取眼球壁完整部位，取材并粘贴于空白包埋块上，超薄切片（片厚70nm），经铅、铀双染后，JEM2000EX电镜观察。
图1大鼠视网膜Ngb免疫金颗粒 A：内节段;B：色素上皮细胞;C：内质网附近及管腔结构外侧;D:突触小泡之间（TEM×40000）（略）
2结果
Ngb表达部位在电镜下表现为高电子密度的免疫金颗粒。除外核层和视锥视杆层的外节段以外，在SD大鼠视网膜的其它各层均有分布，其中又以节细胞和视锥视杆层的内节段出现的免疫阳性颗粒为多（图1A）。在细胞层，免疫金颗粒呈单个散在或几个颗粒聚集分布于神经元及色素上皮细胞的胞质中，在线粒体周围的胞质更为多见，但线粒体内未发现任何阳性着染（图1B）；另外免疫金颗粒也常见于内质网和高尔基复合体附近，但均在其管腔结构的外侧（图1C）；在丛状层，免疫金颗粒主要分布在突触前成分的突触小泡之间（图1D）。
3讨论
脊椎动物的视觉过程非常复杂，光感受器细胞维持暗电流以及感光时的光化学反应、光电转换后神经元突触传递等活动，都需要消耗大量的能量。这些能量都是由糖酵解和氧化磷酸化所产生的ATP来提供的[4,5]。因此，视网膜需要充足的氧供才能发挥其应有的生理功能。视网膜的相对耗氧量要高于脑和其他组织，若以单位重量的组织计算，视网膜是人体内耗氧率最高的组织[6]。但对于啮齿类和人类等大多数哺乳动物来说，视网膜的供血结构却相对薄弱。视网膜中央血管系统只营养内层视网膜，而外层视网膜的血供主要是由脉络膜循环支持，其血液并不直接到达光感受器细胞层，其中的氧也必须经过色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）层才能弥散至光感受器[4,5,79]。由于视网膜是人体内Ngb表达量最高的组织[5,6]，提示Ngb可能在视网膜氧代谢中占有特殊地位。Bentmann等[10]采用抗Ngb和抗细胞色素c对小鼠及大鼠的视网膜组织进行了双标免疫荧光染色，发现细胞色素c和Ngb阳性着色共同分布于光感受器的内节段、内外丛状层和节细胞层，且两者在细胞内的定位基本一致。上述4层正是视网膜组织中氧耗最多的位置，线粒体多集中于此，Ngb也相应的分布于此，表明了Ngb与氧代谢有密切关系。但同时也发现，虽然Ngb和线粒体的阳性着色大部分重叠，却并不完全一致。接近毛细血管的区域即氧浓度更高的区域细胞色素c的浓度更高，而相比之下Ngb则更集中在线粒体相对较少的周围区域。因此推测，该处Ngb可能较氧浓度更高区域，有更高效的促进可利用氧向线粒体弥散的作用。另有研究表明，Ngb的氧亲和力高于Hb而低于细胞色素氧化酶，这一功能参数的水平决定了其在整个氧代谢过程中的参与位置及阶段[11]。我们发现，除外核层和视锥视杆层的外节段以外，Ngb在视网膜其它各层均有分布。在细胞层Ngb定位于细胞质内，线粒体周围多见，内质网和高尔基复合体的管腔外侧也可见Ngb阳性着色。这一发现，更加直观呈现和验证了上述结论。
视网膜的内外丛状层是由相邻二层神经元之间大量的突触联系所构成，神经元通过相互间的突触来传递信息，以实现光电信号的转换。该过程同样需要大量的氧耗。本研究发现较多的Ngb阳性颗粒分布于突触前结构的突触小泡之间，这和突触要完成复杂的生理功能有重要的联系，同时也进一步支持了Ngb与视网膜耗氧有关的假设。内质网是最大的细胞器之一，所有分泌性和膜性蛋白被翻译后均被转移至内质网腔隙中，进行正确的修饰、折叠并组装，形成具有活性的蛋白构象，然后运至高尔基复合体进行进一步加工、分类与包装，再被送到细胞特定的部位或分泌到细胞外[12]。作为一种呼吸蛋白，Ngb由神经细胞产生，也必然会经过一系列的加工和修饰。本研究采用的是针对人Ngb 5570氨基酸序列所制备的抗体，该序列在人、大鼠和小鼠的Ngb结构中是一致的。我们发现，Ngb阳性颗粒在神经元胞质的内质网和高尔基复合体的附近也有散在分布，但都在这些细胞器管腔结构的外侧。这可能与所用Ngb抗体有关，但同时也提示Ngb在成熟前会经历一系列蛋白修饰过程而形成最终的抗原性。该系列蛋白加工过程将受到哪些因素的调控，是否与神经细胞所处内环境的状态有关，相应Ngb量的变化是否为对内环境变化的回馈应答，这些问题有待进一步的研究。对这些问题的正确回答，必将有助于了解神经元中Ngb在体内缺氧条件下表达的变化情况，从而揭示Ngb对神经元发挥保护作用的具体机制。我们还发现大鼠视网膜RPE层也有的Ngb表达，这与Bentmann等[10]所见不同。这种矛盾现象也曾在其他研究中出现。小鼠视网膜RPE层未见Ngb表达[13]，而犬类视网膜RPE层内则可见Ngb的表达，这可能与动物种属、所用抗体及研究方法的敏感性不同有关[14]。出现在RPE层中的Ngb是由RPE细胞自身产生还是Ngb在神经元内产生后的运输和再分布，还有待进一步鉴别。Laufs等[15]认为Ngb在神经胶质细胞中无表达，只特异性表达于神经元；另有研究[1]则显示Ngb在某些内分泌系统（如垂体、肾上腺和睾丸）的非神经元中也有表达。如果只有神经元特异表达Ngb，也许可将Ngb作为鉴定神经元的新型特异性标志物。
Ngb与神经系统的氧代谢之间存在着紧密而复杂的联系。它参与氧的运输，但作用位点在线粒体之外；它由神经细胞分泌并运输到相应的部位（如突触前成分的突触小泡之间）发挥作用。随着对Ngb成熟蛋白结构形成前所经历的一系列修饰加工的影响因素和机制、神经元保护效果和机制以及Ngb生理功能认识的深入，将有望通过生物制药等途径，为临床循环障碍性疾病的防治提供重要的理论依据和新的思路。
【参考文献】
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13 Schmidt M, Giessl A, Laufs T, et al. How does the eye breathe? Evidence for neuroglobinmediated oxygen supply in the mammalian retina. Biol Chem2003;278(3):19321935
14 Ostojic J, Sakaguchi DS, de Lathouder Y, et al. Neuroglobin and cytoglobin: oxygenbinding proteins in retinal neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci2006;47(3):10161023
15 Laufs TL, Wystub S, Reuss S, et al. Neuronspecific expression of neuroglobin in mammals. Neurosci Lett2004;362(2):8386
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