作者：薛炼，姚雯颖，张军，高莉，付清，李闻捷
作者单位：200433）中国上海市，第二军医大学长海医院 实验诊断科；病理科；眼科；（250031）中国山东省济南市，济南军区总院检验科；（201103）中国上海市，武警上海市总队医院检验科
【摘要】 目的： 研究βB2晶体蛋白基因敲除对于小鼠晶状体功能的影响。方法：采用胚胎干细胞打靶技术，培育出基因敲除小鼠。用裂隙灯显微镜观察小鼠晶状体的病变；透射和扫描电镜观察晶状体的超微结构；观察该基因敲除后晶状体形态和功能改变。结果：βB2晶体蛋白基因敲除后，新生的小鼠晶状体发育正常；随年龄增长，小鼠晶状体的质量、直径和正常小鼠比较明显减少；小鼠在生后数月内发生皮质性白内障，其程度随年龄增长而加重；电镜观察显示晶状体细胞纤维排列异常。结论：小鼠βB2晶体蛋白基因敲除导致年龄相关性白内障的发生。
【关键词】 βB2晶体蛋白；基因敲除；白内障
Study of βB2crystallin function and rat cataractogenesis
Lian Xue, WenYing Yao, Jun Zhang, Li Gao, Qing Fu, WenJie Li
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 30470681)
Department of Laboratory Medicine, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;Department of Diagnosis, General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese PLA, Jinan 250031, Shandong Province, China;Shanghai Municipal Corps Hospital, Chinese People's Armed Police Forces, Shanghai 201103, China; Department of Pathobiology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; Department of Ophthalmonlogy, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract AIM: To study the effect on lens by generating mice with a targeted disruption of βB2. METHODS: Gene targeting in embryonic stem cells was used to generate mouse lines in which βB2 was deleted. Knockout mice were screened for lens abnormality with slit lamp biomicroscopy. Microstructure of lens was analyzed by scanning and transmission electron microscopy. The effect on lens morphology and function was observed.RESULTS: The lens appeared to develop normally in the first months of life. In older animals, the weight and axial diameter of the lenses of knockout mice were significantly smaller than those in wild type. Cataracts were formed in the cortex several months after birth and cataract severity increase with age. Electron microscopy showed that the fiber cells were irregularly aligned. CONCLUSION: Cataracts are formed in the cortex several months after birth and cataract severity increase with age.
KEYWORDS: βB2crystallin gene; knockout; cataract
晶状体维持透明主要依赖于晶体内富含水溶性晶体蛋白。晶体蛋白主要有三大类：α，β和γ。在哺乳类动物，α晶体蛋白占晶体蛋白总重量约50％[1]。α晶体蛋白包括αA和αB两种，两者的氨基酸序列大约60％相同[2,3]。α晶体蛋白既是晶状体的结构蛋白又具有分子伴侣作用，可以协助其他类晶体蛋白抵抗蛋白的翻译后修饰，有助于维持晶状体透明性。β晶体蛋白包含βA(βA1,βA2,βA3,βA4)和βB(βB1,βB2,βB3)2类[4,5]。目前，β晶体蛋白主要被认为是结构蛋白，其它功能报道较少。现已有多个晶体蛋白基因敲除动物模型被用来研究晶体蛋白功能[6,7]。小鼠βB2基因（Crybb2 ，GeneID：12961） 位于5号染色体，含5个外显子。对应蛋白质由205个氨基酸组成，分子质量23379.20Da，等电点6.54。在哺乳类,βB2晶体蛋白主要表达于晶状体内；在啮齿类，该蛋白主要在出生后表达[8]。βB2晶体蛋白在低浓度时易形成二聚体[9]；高浓度时常与其它β类晶体蛋白形成异寡聚体[10]。我们采用课题组前期建立的βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型，观察基因敲除后小鼠晶状体发育状况；探讨βB2晶状体蛋白在晶状体发育和维持晶状体透明性中的作用。
1材料和方法
1.1材料 βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立参见文献[11]。
图1βB2基因敲除与野生型小鼠晶状体变化 A:质量;B:直径（略）
图2裂隙灯检测βB2基因敲除小鼠白内障随年龄发展 A:4mo;B:6mo;C:12mo;D:18mo（略）
1.2方法 选取不同年龄组的小鼠，分离晶状体，用电子天平进行称质量，并以游标卡尺测量小鼠晶状体直径。采用10g/L的托吡卡胺和50g/L的新福林交替滴眼散瞳。约25min后以裂隙灯观察小鼠晶状体的病变。取小鼠眼球，以pH为7.2,50mmol/L的二甲胂酸钠溶液（含25g/L戊二醛和60g/L 蔗糖）固定过夜。随后以含OsO4的150mmol/L PBS(pH 7.4)固定、包埋、切片，分别用Hitachi H800透射电镜和Hitachi H520扫描电镜进行观察。
统计学分析:所有数据以±s表示，组间比较采用独立 t检验。P<0.05 差异有统计学意义。
2结果
2.1小鼠晶状体发育 基因敲除小鼠晶状体外形在刚出生后和野生型比较，没有明显异常。随着小鼠年龄增长，基因敲除小鼠晶状体的质量和直径都小于野生型，并且这种差距随着年龄增长逐渐加重。18mo的基因敲除小鼠比野生型下降34% (图 1A)；直径小5% (图 1B)。
2.2白内障的检测 裂隙灯检测发现基因敲除小鼠在6～8wk出现晶状体白内障，且随年龄增长逐渐加重。后皮质区域最先出现散在的混浊区域（6～8wk）；到4mo时变得非常明显(图2A)。6mo时前皮质也出现明显的混浊区域(图 2B)。1岁龄时，晶状体混浊非常明显，在人字缝区域可以看到典型的类似鱼刺样改变(图 2C)。18mo的小鼠整个晶状体发生混浊(图 2D)。对照小鼠没有发生白内障。
2.3电镜观测结果 6月龄基因敲除小鼠扫描电镜显示晶状体纤维细胞排列不规则，并有突起(图 3A)。对照小鼠晶状体纤维成放射状排列，排列规则(图 3B)。 透射电镜显示基因敲除小鼠晶状体细胞发生扭曲变形(图 3C)，而野生型形态规则(图 3D)。
图36月龄小鼠晶状体超微结构的变化 A:扫描电镜基因敲除;B:扫描电镜野生型;C:透射电镜基因敲除;D:透射电镜野生型（略）
3讨论
βB2基因在啮齿类是一个出生后表达基因，其表达主要在出生后1wk内快速增长，在晶体蛋白总量中所占比例逐渐增加。由此推测βB2基因及其蛋白在晶状体的初始发育过程中没有明显功能；对晶状体的作用更多的是后天参与维持其透明性。βB2基因敲除小鼠较快发生了年龄相关性白内障。基因敲除小鼠在出生时，小鼠晶状体的质量和直径和野生型没有差异，随着小鼠年龄的增长，基因敲除小鼠晶状体的直径和质量都较野生型明显下降，并且发生了年龄相关性白内障。这也提示βB2晶体蛋白主要参与晶状体出生后的透明性维持。
晶状体的透明性依赖于晶体蛋白的可溶性。在动物生命周期中，很多因素（氧化、受热、蛋白酶裂解和脱氨基作用等）可以修饰晶体蛋白，导致晶体蛋白变性，变成不溶性蛋白，进而导致白内障的发生。由βB2晶体蛋白表达及其基因敲除后的表现特征，进一步提示该蛋白不仅仅是一个结构蛋白，而且具有维持和保护其它蛋白免于变性的功能[12 ，13]。基因敲除后导致βB2晶体蛋白功能的缺失，小鼠容易发生快速年龄相关性白内障。扫描电镜显示βB2基因敲除后晶状体纤维排列异常，透射电镜显示晶状体细胞扭曲变形。由于晶体蛋白是填充晶状体纤维的主要成份，而且随年龄老化βB2晶体蛋白含量渐趋升高，因此，这种晶状体纤维的变形是否是由于该高含量蛋白缺失导致结构改变所致？还是由于βB2晶体蛋白功能缺失，导致相关晶体蛋白变性、聚集，使晶状体纤维变形？尚需进一步探讨。
总之，我们发现,βB2基因敲除小鼠模型发生了较快的年龄相关性白内障，其白内障发生的区域主要位于晶状体的皮质层；伴发白内障的严重程度随年龄增加而逐渐加重，提示βB2晶体蛋白在维持晶体蛋白的水溶性和晶状体的透明性中起重要作用。
致谢：翁伟博士(美国inGenious Targeting Laboratory CEO)设计、实施并慷慨提供βB2基因敲除小鼠。
【参考文献】
1 Brady JP，Garland D，DuglasTabor Y, et al. Targeted disruption of the mouse alpha Acrystallin gene induces cataract and cytoplasmic inclusion bodies containing the small heat shock protein alpha Bcrystallin. Proc Natl Acad Sci U S A1997;94:884889
2 Bloemendal H，de Jong WW.Lens proteins and their genes. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol1991;41:259281
3 Bloemendal H，de Jong W，Jaenicke R, et al. Ageing and vision: structure, stability and function of lens crystallins. Prog Biophys Mol Biol2004;86:407485
4 Berbers GA, Hoekman WA, Bloemendal H, et al. Homology between the primary structures of the major bovine betacrystallin chains. Eur J Biochem1984;139:467479
5 Lampi KJ, Ma Z, Shih M, et al. Sequence analysis of betaA3, betaB3, and betaA4 crystallins completes the identification of the major proteins in young human lens. J Biol Chem1997;272:22682275
6 Horwitz J. Alphacrystallin. Exp Eye Res2003;76:145153
7 Xi JH, Bai F, Andley UP. Reduced survival of lens epithelial cells in the alphaAcrystallinknockout mouse. J Cell Sci2003;116:10731085
8 Aarts HJ，Lubsen NH，Schoenmakers JG. Crystallin gene expression during rat lens development. Eur J Biochem1989;183:3136
9 Hejtmancik JF, Wingfield PT, Sergeev YV. Betacrystallin association. Exp Eye Res2004;79:377383
10 Trinkl S, Glockshuber R, Jaenicke R. Dimerization of beta B2crystallin: the role of the linker peptide and the N and Cterminal extensions. Protein Sci1994;3:392400
11张军，黄才国，李闻捷，等.βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立.第二军医大学学报2006;27:12461249
12 Feng J，Smith DL，Smith JB. Human lens betacrystallin solubility. J Biol Chem2000;275:1158511590
13 Zhang Z，David LL，Smith DL, et al. Resistance of human betaB2crystallin to in vivo modification. Exp Eye Res2001;73:203211
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