作者：王柏川 叶剑    作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所 眼科，重庆

    【摘要】  目的 探讨转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）受体在不同年龄SD大鼠晶状体上皮细胞中的表达变化及意义。方法 按1、3、6个月鼠龄分为3组，采用晶状体前囊膜铺片方式，应用荧光免疫组化技术进行TGF-β受体TGF-βR1和TGF-βR2的荧光免疫组化染色，检测其蛋白水平的表达；采用剥取晶状体囊膜组织方法，应用RT-PCR技术检测TGF-βR1和TGF-βR2在转录水平的表达。结果 在蛋白水平，TGF-βR1和TGF-βR2于1个月鼠龄组表达最强，IOD分别为478001±44417和778338±62596； 3个月鼠龄组表达减弱，分别为360343±33196和360343±33196；6个月鼠龄组表达最弱，分别为225858±23483和274648±29801，组间差异有显著性（P<0.05）。在转录水平，TGF-βR1和TGF-βR2 mRNA表达量在1个月龄组分别为3.0±0.9和3.4±1.1；3个月龄组分别为2.1±0.6和2.6±0.8； 6个月龄组分别为1.3±0.3和1.6±0.5，随着年龄的增加而减弱（P<0.05）。结论 大鼠晶状体上皮细胞中TGF-βR1和TGF-βR2的表达随年龄的增长而减弱，提示对TGF-β的敏感性与年龄呈负相关。

    【关键词】  转化生长因子β 转化生长因子受体 晶状体上皮细胞

    转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一类多功能的调节细胞生长、分化的细胞因子，它对晶状体上皮细胞的影响主要表现为促进晶状体上皮细胞分化，抑制晶状体上皮细胞的增殖，并与晶状体上皮细胞的纤维化生长及凋亡密切相关，在白内障形成机制中有重要作用。TGF-β是通过与相应受体的结合而发挥其生物学作用的，我们拟通过RT-PCR与荧光免疫组化手段，了解不同年龄段大鼠晶状体上皮细胞中转化生长因子β受体（TGF-β receptors，TGF-βR）表达的变化，探讨TGF-βR的表达与年龄间的关系。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组  健康SD大鼠来自第三军医大学野战外科研究所实验动物中心，鼠龄1~6个月，雌雄不限，动物质量符合国家《实验动物管理条例》。根据鼠龄分为3个实验组，即1个月鼠龄组（85~100 g）、3个月鼠龄组（280~310 g）和6个月鼠龄组（330~420 g）。

    1.2  仪器与试剂  解剖显微镜（Leica MZ95），激光共聚焦显微镜（Leica TCS NT），PCR仪（Bio-Rad），水平电泳仪（Bio-Rad），凝胶成像仪（Bio-Rad）；TGF-βR1、TGF-βR2兔抗人多克隆抗体（武汉博士德），标记FITC羊抗兔IgG及碘化丙啶（北京中杉），Tripure（罗氏公司），RT-PCR试剂盒（TaKaRa生物工程有限公司），PCR引物根据TGF-βR1 mRNA序列（L26110）和TGF-βR2 mRNA序列（NM031132）进行设计，内参引物根据GAPDH mRNA序列（NM002046）设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其序列见表1。

    1.3  转化生长因子受体的荧光免疫组织化学染色

    SD大鼠经腹腔麻醉后，摘取双眼球，于角膜缘处剪开眼球壁，取出晶状体，在解剖显微镜下撕取前囊膜组织片，平铺于防脱载玻片上，细胞面朝外，以多聚甲醛固定1 h；0.01M PBS漂洗10 min×2次，正常羊血清封闭30 min，0.01M PBS漂洗10 min，加一抗（TGF-βR1或TGF-βR2，1:20），37℃孵育1 h，室温过夜，0.01M PBS漂洗10 min×3次，加荧光二抗（羊抗兔/FITC，1:50），37℃孵育1 h，0.01M PBS漂洗10 min×3次，以碘化丙啶（PI）行胞核复染10 min后，用甘油封片，于激光共聚焦显微镜下观察并在相同条件下摄片；每个实验组取4只大鼠，可获得8个前囊膜铺片，分别行TGF-βR1、TGF-βR2检测，以绿色荧光为阳性表达，每张玻片随机取3个视野摄片，利用Image-Pro Plus 6.0软件计算每个视野中绿色荧光的累积光密度值（IOD）。

    1.4  转化生长因子受体的逆转录-聚合酶链反应

    1.4.1  总RNA提取  取2只大鼠共4个晶状体，剥取囊膜组织并剪碎，加入1 ml TriPure，振荡、混匀后室温静置5 min，加入氯仿0.2 ml，混匀后室温静置15 min，离心（4℃，12000×g）15 min，吸取上层透明液体约0.25 ml，加入异丙醇1ml，混匀后室温静置10min，离心（4℃，12000×g）10 min，弃上清液，加入75%乙醇1 ml，混匀并离心（4℃，7500×g）5 min，弃上清液，加入无水乙醇1 ml，混匀并离心（4℃，7500×g）5 min，弃上清液，加入10 μl DEPC水溶解，即得到所需总RNA。测OD值（260 nm/280 nm）均在1.8~2.0间，提示RNA纯度理想，RNA浓度为120~140 μg/ml，提示RNA含量较低。每个实验组各取8只大鼠，每组可获得4个RNA样本，进行逆转录及PCR扩增。

    1.4.2  逆转录（RT）  取总RNA 0.5 μg，分别加入MgCl2 2 μl，10×RT Buffer 1 μl，dNTP Mixture 1 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl，AMV逆转录酶0.5 μl，Oligo-dT 0.5 μl，补足去离子水，配制成10 μl反应体系；经30℃反应10 min，42℃反应30 min，99℃反应5 min，5℃反应5 min后，得到RT产物。

    1.4.3  PCR扩增  取1 μl RT产物作为模板，分别加入5×PCR Buffer 5 μl，Taq酶0.125 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，去离子水16.875 μl，配制成25 μl反应体系；先经变性94℃ 5 min，再通过变性94℃ 30 s，退火（TGF-βR1 58.7℃，TGF-βR2 61.5℃，GAPDH 58℃）30 s，延伸72℃ 45 s，循环35次，最后再延伸72℃ 10 min，得到PCR产物；各取5 μl PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（80 V，   1 h），凝胶成像仪摄片并计算目的条带光密度值，以GAPDH光密度值作为标准对比。

    1.5  统计学方法  所得数据利用SPSS 8.0软件，以x±s表示，采用单因素方差分析方法。

    2  结果

    2.1  大鼠晶状体上皮细胞中TGF-βR1和TGF-βR2的表达及分布  TGF-βR1在大鼠晶状体上皮细胞中主要表达于胞膜及胞浆，呈非均一性的颗粒样阳性着色，并且大多数细胞都表达TGF-βR1（见图1-A~C）；TGF-βR1在1个月鼠龄组表达较强，  3个月鼠龄组表达减弱，6个月鼠龄组表达最弱，提示TGF-βR1在大鼠晶状体上皮细胞中的表达随年龄的增长而减弱（见表2）。

    TGF-βR2在1个月鼠龄组主要于分布胞核、胞浆与胞膜（见图2-A），且表达较强；在3个月鼠龄组可见胞浆表达明显减少，胞膜表达已不明显（见图2-B），主要见于胞核及核周胞浆表达；在6个月鼠龄组，TGF-βR2的分布与2个月鼠龄组相似（见图2-C），但表达进一步减弱，各组差异有显著性（P<0.05），提示TGF-βR2在大鼠晶状体上皮细胞中的表达随年龄的增长而减弱（见表2）。

    2.2  RT-PCR结果  PCR产物凝胶电泳结果显示，每组样本可扩增出3个目的条带，分别为457 bp的TGF-βR1、328 bp的TGF-βR2和392 bp的GAPDH（见图3）；GAPDH在三组样本中表达稳定，无明显差异（P>0.05），TGF-βR1和TGF-βR2在1个月鼠龄组表达最强，在3个月鼠龄组表达减弱，在6个月鼠龄组表达进一步减弱；计算光密度比值（TGF-βR/GAPDH）作为TGF-βR1和TGF-βR2 mRNA的表达量（见表3），经检验，各组内差异有显著性（P<0.05），提示TGF-βR1和TGF-βR2在大鼠晶状体上皮细胞中mRNA的表达随年龄的增长而减弱。

    3  讨论

    TGF-β对晶状体上皮细胞的主要作用是抑制细胞增殖，促进细胞分化，这种分化作用包括两个方面，一方面是促进晶状体立方形上皮细胞分化为晶状体纤维细胞，是正常的生理发育过程；另一方面则是促进上皮细胞异常分化，导致细胞变长、梭形细胞样改变以及成纤维细胞化，并且可致细胞内细胞器减少，RNA聚集，细胞质凝集，二级溶酶体明显增多等，出现细胞凋亡[1-2]，是一个病理过程，与白内障形成关系密切。已有实验表明，TGF-β可在体内及体外引起白内障样改变[3-5]。

    TGF-β通过与相应受体结合，引发信息传递，从而发挥其生物学作用。TGF-β受体主要有TGF-βR1、TGF-βR2和TGF-βR3三型，其中TGF-βR3并不参与信号传递过程，也不介导TGF-β的生物学效应，TGF-βR1、TGF-βR2是主要的功能性的受体，介导几乎所有的TGF-β功能，TGF-βR1要有TGF-βR2的同时参与才能与TGF-β结合，而TGF-βR2虽然不需要TGF-βR1的存在就可以与TGF-β结合，但必须有TGF-βR1同时参与才能进行信息传递，因此，两种受体形成聚合体对于TGF-β和细胞之间的信息传递十分重要[6]。研究TGF-β对晶状体上皮增殖与分化的影响时，应考虑到其相应受体表达的情况。有关晶状体上皮细胞TGF-β受体表达与年龄间的关系少见报道。我们实验中采用的1~6个月龄大鼠，大致反映了大鼠由幼年到成年的变化。结果提示，大鼠由幼年至成年过程中，晶状体上皮细胞中TGF-βR1和TGF-βR2在转录及蛋白水平的表达逐渐降低，提示对TGF-β的敏感性与年龄呈负相关，说明晶状体发育成熟后，其上皮细胞分化活动逐渐减弱，进入一个发育稳定期。

    白内障手术后，房水中bFGF和TGF-β含量增加[7]，bFGF促进残留的上皮细胞增殖并移行到后囊膜，TGF-β则促进上皮细胞转分化为梭形细胞，多层排列，聚集成斑块样，使囊膜皱缩，形成后发障[8]。我们的结果发现，幼年晶状体上皮细胞比成年晶状体上皮细胞同时表达更多的TGF-β1和TGF-β2受体，提示两者形成的聚合体对TGF-β更敏感，也说明儿童白内障术后比成人更容易发生后发障。

    长期应用糖皮质激素可引起激素性白内障，可能也与TGF-β或/和TGF-β受体异常表达有关，由于糖皮质激素可能影响TGF-β受体表达，增殖、移行至赤道部的晶状体上皮细胞不能正常分化，则继续移行至后囊下堆集，形成后囊下混浊[9-10]。流行病学资料表明，儿童较成人对激素更敏感，更易发生激素性白内障[9-11]。从受体表达角度分析，可能是发育过程中，幼年晶状体上皮细胞中较成年晶状体有更多的TGF-β受体表达，因糖皮质激素的抑制作用，幼年晶状体上皮细胞中TGF-β受体较成人下降剧烈，细胞的正常分化抑制更明显，而成人晶状体上皮细胞已处于发育稳定期，虽然TGF-β受体表达也受到抑制，但所受到的影响不如处于旺盛发育过程中的幼年晶状体上皮细胞。

    由以上分析可以看出，由于儿童晶状体上皮细胞表达更多的TGF-β受体，对TGF-β敏感，使得更容易发生后发障及激素性白内障，因此我们推测，儿童有可能较成人更容易发生与TGF-β及其受体密切相关的晶状体疾病。

    【参考文献】

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    [2] Banh A, Deschamps PA, Gauldie J, et al. Lens-specific expression of TGF-?茁 induces anterior subcapsular cataract formation in the absence of smad3[Ｊ]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(8):3450-3460.

    [3] Hales AM, Chamberlain CG, Dreher B, et al. Intravitreal injection of TGF beta induces cataract in rats[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(13):3231-3236.

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    [5] de Iongh RU, Wederell E, Lovicu FJ, et al. Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition in the lens：a model for cataract formation[J]. Cells Tissues Organs，2005，179(1):43-55.

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    [10] Symonds JG, Lovicu FJ, Chamberlain CG. Differing effects of dexamethasone and diclofenac on posterior capsule opacification-like changes in a rat lens explant model[J]. Exp Eye Res,2006，83(4):771-782.