【摘要】 目的：研究人眼ALDH1A1的结构与功能学特点。方法：使用标准的PCR技术，从人晶状体cDNA文库扩增ALDH1A1。扩增的ALDH1A1（1.5kb）被插入到克隆表达载体pET28b，再转染到菌株BL21DE3中。表达出来的蛋白质经Histag柱纯化，使用 thrombin切除Histag。对纯化的ALDH1A1的酶学特点，如酶活性与辅酶、缓冲液、还原剂、pH以及析出方式等的关系进行了检测。结果：从人晶状体的基因文库，成功扩增了ALDH1A1，重组的人晶状体ALDH1A1为1506bp的DNA及501个氨基酸组成，分子量为54.8kDa，PI=6.8。与人的肝脏ALDH1A1 100%同源，与大鼠和小鼠肝脏的ALDH1A1有85%的同源性。Thrombin酶切较imidazole洗脱的ALDH1A1活性保持得更持久，纯化的ALDH1A1在碱性的sodium pyrophosphate反应缓冲液中，NAD为辅酶和dTT作为还原剂时的活性较高，其活性随pH增高而增加。结论：ALDH1A1与人肝组织的同工酶有相似的作用。
【关键词】 白内障 脂质过氧化 ALDH HNE
0引言
老年性白内障为全球主要的致盲眼病，目前全世界约有五千万的人患白内障[1]。尽管白内障摘除及人工晶状体植入手术为疗效非常好的一种复明手术，但每年庞大的手术开支和意外并发症[2]，使得世界一些科学家们仍在坚持不懈地研究病因及寻找有效的药物去代替手术。白内障为年龄相关的老年性疾病，其病因仍然不清，目前比较公认的理论为持续的紫外线日光照引起的脂质过氧化为白内障的主要危险因素[3,4]。光量子的吸收导致组织产生氧自由基，并与组织中的脂质反应，产生过氧化醛类, 此脂质衍生的醛类（lipid derived aldehyde, LDA）对人类和动物的组织细胞都有毒性作用，如4羟基壬烯醛（4hydroxynonenal，HNE)为组织细胞中最具毒性和含量丰富的一种醛类。我们早期的研究表明微摩尔的HNE（μmol/L）即可诱导人的晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells，HLEC）发生显著凋亡，以及使大鼠的晶状体发生白内障 [5,6]。其结构中活跃的双键（C=C，C=H）可与组织中的氨基酸形成michael adduct 和schiff base，从而干扰信号传导，DNA合成和酶的活性。所以对于这些组织来说，如何有效的清除来自脂质过氧化的毒性醛类是非常重要的。
醛类如HNE代谢的一个重要途径为在醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)的作用下形成4hydroxy2nonenoic acid (HNA)[7,8]。我们早期的研究表明 ALDH1A1为晶状体重要的同工酶，在HNE的代谢去毒中起着重要的作用从而参与维持晶状体的透明性 [9]。目前人肝脏、大鼠肝脏、鸡视网膜等ALDH1A1已经被重组和研究 [1013]，但人晶状体ALDH1A1结构和酶学特点还未有报道。为了解人眼晶状体中的ALDH1A1的重要作用，我们对其进行了克隆、重组和酶学特点的研究。
图1 重组的人晶状体ALDH1A1基因为1条1.5 kb的DNA带（3,5 和7） 1: Lamda DNA/HindIII 分子量标准;2,4,6:Nde I和Xho I酶切前的ALDH1A1克隆#1,2,3；3,5,7:Nde I和Xho I酶切后的ALDH1A1克隆#1,2，3；8:100bp DNA分子量标准（略）
1材料和方法
1.1材料 人眼晶状体cDNA来自于人眼基因文库（human eye library,HEL），使用特异性的ALDH1A1，ALDH2A1，ALDH3A1引物，从人眼晶状体cDNA进行基因的扩增，扩增出的ALDH1A1 PCR产物为1.5kb的DNA。ALDH1A1的载体选用蛋白质表达质粒pET28b（Novagen,San Diego,CA），ALDH1A1的PCR 产物和载体pET28b 通过相应的限制性酶切，然后实行标准的连接，插入的基因经限制性酶切片段来确认。
1.2方法 50～100ng的ALDH1A1pET28b质粒加100μL的BL21DE3 表达菌种( Navogen,San Diego, CA)，接种到含有卡那霉素的琼脂培养皿中，置于37℃培养箱过夜，挑取单个生长菌种接种到含有50mg/L卡拉霉素的LB培养液中培养，收获细菌并使用Qiagen plasmid kit (Qiagen,Valencia,CA)提取质粒DNA。 取双链ALDH1A1 质粒1.0μg加T7 forward 和T7 reverse引物进行DNA扩增及测序（ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer，Applied Biosystems, Foster City, CA)，成功扩增的含ALDH1A1质粒的菌种被置于300mL/L甘油中于80℃冰箱储存备用。转染ALDH1A1质粒的BL21DE3细胞株加于LB培养基中，在37℃下250r/min摇荡生长，当OD值达0.70～0.90时加1mmol/L的IsopropylbD1thiogalactopyranoside （IPTG）以诱导蛋白质的产生。为确定最佳诱导时间，在诱导培养0，4，6，10，12，14和24h后，各取1mL的样本分别跑SDSPAGE胶和测ALDH活性，得出的结果说明12h的诱导后产量最高。所以大样本的培养在12h后，收集培养液500mL的细菌株加的匀浆液( 100mmol/L sodium phosphate,2mmol/L EDTA)20mL及蛋白酶抑制剂1mL和1mmol/L dTT，进行超声细胞粉粹， 离心后经NiHis tag 柱过滤，ALDH1A1蛋白质将附着于Histag柱上，而其它蛋白质将随洗脱液洗出， 带有Histag的ALDH1A1蛋白质经凝血酶（thrombin，Novagen San Diego, CA) 室温下作用4～5h从Histag柱上游离出来 ，纯化的ALDH1A1用 CLC Capillary 494 Protein Sequencing System(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行蛋白质氨基酸序列分析以确定其氨基酸序列。纯化ALDH1A1蛋白质50μg在不同的反应体系如0.1mol/L TrisHCl或100mmol/L sodium pyrophosphate缓冲液（ pH 7.0～9.0）；不同的辅酶如 NAD或 NADP；不同的还原剂如1mmol/L dTT或10mmol/L βmercaptoethanol等，在1mmol/L的底物propionaldehyde作用下使用分光光度计（Cary 100UVVis spectrophotometer，Palo，Alto， CA）室温下测定340nm波长的OD变化值共5min，所有实验重复3次。
图2 重组的人晶状体 ALDH1A1 DNA序列（1506bp）（略）
图3 重组的人晶状体ALDH1A1氨基酸序列(501氨基酸)（略）
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