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2.2.2角膜各层特点
前弹力层：当图像部分出现上皮基底细胞层，另一部分出现前基质细胞层时，二者之间即为前弹力层，但此膜无细胞结构，同时伴有上皮下神经丛出现。角膜基质层：在图像的暗背景下能衬托出发亮的细胞核，未能观察到细胞质、细胞边界及胶原层，细胞核间有不定形的黑色背景分割；细胞核的形态为成骨细胞状、纺锤状及椭圆形，前基质层细胞核呈多形性，其中骨细胞状细胞核较多（图2A），后基质层细胞越接近内皮层，细胞核越变得细长，梭型和椭圆形细胞核比例增多（图2B）。有4眼（18%）在中后基质层中可见到微皱褶，表现为黑色背景下条索状低密度区，宽度和排列较规则，宽度多＜10 μm，呈纵向或斜向排列（图2C）。后弹力层：当图像部分出现内皮细胞层，另一部分出现后基质细胞层时，二者之间即为后弹力层，此膜无细胞结构。角膜内皮层：内皮细胞边界呈黑色低反光，胞体明亮，表面平整，细胞大小较均匀，排列规则，六边型镶嵌体较多，亦可见五边形等异形细胞；有2眼（9%）见内皮层表面呈局灶性向前房圆丘状隆起的结构，直径约15～40μm，类似滴状赘疣（图2D）。
2.2.3角膜内神经组织
正常的上皮基底细胞层下神经丛致密、相互交织呈网状，分支多，呈树枝状自然分叉，中等强度反光，有大量长度≥50μm的细小神经纤维分枝，神经纤维上可见大量高反光微串珠样或球样结构（图3A）；中、后基质内神经源自角膜缘发出的神经干，直径比较粗（≥5μm），分枝呈粗树干状两分叉结构，反光强于基底细胞层下神经丛；无微串珠样或球样结构；偶见伴有细小分枝（图3B）。
3讨论
角膜上皮层从内向外依次为上皮基底细胞﹑翼状细胞、表层细胞。其中基底细胞为单层柱状细胞，是上皮层的生发层，排列整齐，细胞之间连接致密；随着上皮组织的生长，成熟或老化的细胞逐渐被推向翼状细胞层和表层细胞层，细胞形态从柱状向扁平状变化，随成熟程度不同，细胞体积变的不规则，细胞之间连接变的疏松，表层可见凋亡脱落的细胞；CMTF观察时，光学切面与柱状细胞垂直，因此见到基底细胞层如“斑马皮样”外观；从基底细胞到表层细胞，我们观察到细胞边界反光逐渐增强，这是细胞间连接变的疏松及含水量增加的结果；在表层细胞层，我们观察到高反光无细胞核的扁平细胞，这是表面膨胀水肿的凋亡细胞因细胞内含水量增加所至，而低反光细胞脱失区，则是已经坏死的细胞脱落后的缺失区。CMTF观察时，扫描顺序从内皮层向上皮层，表层细胞层在扫描的最后，这时患者多开始不耐受，出现细小的运动，尤其是老年人，对于只有1～2层细胞的表层细胞是最难观察到，因此，本组病例未做表层细胞记数。上皮从内向外，随细胞逐渐成熟，细胞与细胞核体积逐渐增大，细胞密度逐渐减少，本组研究观察到，基底细胞直径约10μm，而最表层细胞直径增大为30～50μm；国外学者用扫描共聚焦显微镜观察报道[4，5]上皮表层细胞与基底细胞密度的比例为1∶5～1∶10。目前国内外学者[1，57]一致认为，角膜上皮层的各层细胞密度不随眼别和性别的变化而变化，本文结果也赞同这一观点；同时国内外学者一致认为，角膜上皮各层细胞密度不随年龄变化而变化。另外，Eckard等[5]应用激光共焦显微镜观察不同年龄人类角膜上皮组织时发现，表层上皮反光随年龄的增加而增加，他认为这是因为随年龄的增加，表层上皮微绒毛和微皱襞逐步减少，使细胞表面变的光滑，从而反光增加。不同年龄组的角膜基质层细胞密度各不相同。谢立信等[6]报道5～14岁儿童角膜前后基质层细胞数目较成人及老年人组明显升高。Hollingsworth等[8]报道角膜基质层细胞密度随年龄的增加而下降，角膜前后基质层细胞密度年递减率分别为0.48％，0.22％，前基质层细胞密度随年龄下降速率快的原因与上皮层不间断的慢性损伤有关。本组研究对象为国人正常老年人，术前角膜前后基质层细胞数目分别为859±137/mm2和627±184/mm2，略低于孙明霞等[7]报道的1099.10±164.90/mm2，754.37±90.37/mm2。原因：1）在应用CMTF时，扫描范围为340μm×255μm，景深8μm；孙明霞等[7]应用CMTF时，扫描范围同样为340μm×255μm，而景深设定为10μm；同样窗口大小，景深越大，能够分辨出清晰图像的每一光学切片厚度越厚，所包含的基质层细胞数目越多，因此，即使同样标本，但设定景深不同，所得结论也不同，8μm景深每一窗口的细胞数目比10μm景深者少约20％；2）本组观察对象为老年人，平均年龄70.71±6.75岁，而孙明霞等[7]报道的观察对象平均年龄为36.6±14.5岁。本组患者中，术前有4眼在其角膜中后基质层发现微皱褶，这一现象与Hollingsworth等[8]报道60，70，80岁老年人的角膜中后基质层微皱褶的发生率分别为10％，18％，29％的结果相似。目前有关正常老年人角膜中后基质层微皱褶的发生原因尚无定论，但根据张健等[9]报道，超声乳化术后角膜基质层水肿所致微皱褶的发生率明显增高这一现象，我们推断老年人角膜内皮水屏障功能的下降可导致角膜中后基质层水含量的增加，可能是微皱褶发生的主要原因。国内外学者应用CMTF观察生理状态下角膜内皮细胞密度变化时报道[1，68，10]角膜内皮细胞密度随年龄的增加而下降，其下降速率约为0.3%～0.5%/a，谢立信等[6]和孙明霞等[7]报道，老年组内皮细胞密度分别为2700mm2和2739mm2，我们的结果为2529±654mm2；同时我们见到2眼（9%）内皮层表面呈局灶性向前房圆丘状隆起的假性滴状赘疣结构，这和Hollingsworth等[8]报道的结果一致，Hollingsworth等同时观察到60，70，80岁年龄组内皮细胞层假性滴状赘疣的比例为6%，12%和29%。Krachmer等[11]和张健等[12]观察到角膜炎性反应后和超声乳化手术后角膜内皮水肿时同样出现假性滴状赘疣，提示这种变化与炎症反应和内皮层损伤后所致的内皮细胞水肿、营养不良和细胞凋亡有关。角膜内皮镜和CMTF均能活体观察角膜内皮形态变化，角膜内皮镜检查时镜头不与患者接触，具有操作方便、快捷，受检者无任何痛苦等优点，适用于白内障手术前对角膜内皮的普查以及儿童、老人等不配合人群的角膜内皮检查工作，其对角膜厚度和内皮细胞图像定性、定量分析时计算较准确可靠，但由于其光学放大倍数低（60～200倍），用于内皮细胞形态学和超微结构观察时图像模糊不清。与角膜内皮镜比较，CMTF放大倍数高（1000倍），能够显示内皮细胞形态和其超微结构，图像真实、具有立体感等优点。但其对角膜全程扫描过程需要约1min，在做层面扫描时容易受到患者体位、呼吸和心跳变化等影响，结果可重复性较差，另外，检查时镜头需要与角膜接触，对于不配合人群无法进行检查，操作也不如NCSM方便、快捷，不能用于普查工作。角膜神经从角膜中、后2/3角膜缘进入角膜，脱去髓鞘后放射状向前、中央行走,在前弹力层下相互吻合构成上皮下神经丛，该神经丛发出分支，垂直穿过前弹力层，走行于上皮基底细胞与前弹力层之间，末端膨大呈球状，形成上皮内神经丛，其中上皮内神经丛最丰富，这也是本研究在观察角膜神经丛时选取上皮基底细胞下神经丛作为研究对象的原因。本组观察发现，角膜中、后基质神经直径明显粗于上皮基底细胞下神经，每幅图像基底细胞下神经总长度又明显长于中、后基质神经，而内皮层中未见神经行走，再次证明了中外学者公认的角膜神经组织结构[1315]。应用CMTF观察上皮基底细胞下神经丛密度和形态是否与年龄相关，中外学者报道不一：Erie等[16]发现年龄与角膜神经密度无相关性，而张梅等[17]和刘小伟等[18]报道，年龄与神经丛的密度、分支数量呈负相关性；Laura等[13]观察平均年龄为32岁的14眼时发现，神经密度为825.9±318.9μm，直径为2.9±0.2μm，神经分支为8.7±4.6条，串珠结构密度为22.2±4.3/100μm，他的观察窗口大小为0.07434mm2，经统一窗口大小计算后，我们发现我们的观察结果在神经密度、神经直径和神经分支数值与Laura等结果相近，但串珠结构密度明显少于Laura等的结果，是观察方法不同所致，还是不同年龄组神经结构不同引起，有待进一步研究。
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