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应用共聚焦显微镜观察正常老年人角膜形态学的特点

http://www.cnophol.com 2009-4-8 10:31:54 中华眼科在线

【摘要】    目的:探讨正常老年人共焦显微镜下角膜各层组织的活体细胞形态学特征。方法:正常老年人19例22眼中央角膜应用共聚焦显微镜(confocal microscope through focus,CMTF)进行观察,记录上皮翼状细胞层、上皮基底细胞层、前基质层、后基质层、内皮层的细胞密度,选取每人上皮基底细胞层下神经丛和中后基质层神经最清晰图像,并记录此幅图像中神经纤维总长度、神经纤维直径、神经纤维数目和每100μm神经纤维包含的念珠状结构(beads)数目,同时比较不同眼别及不同性别之间上述计量和计数资料之间的差别;观察上皮翼状细胞层、上皮基底细胞层、前基质层、后基质层、内皮层及上皮基底细胞层下神经丛(subbasal epithelial nerve plexus)和中后基质层神经(stromal nerves)的组织形态。
结果:上皮翼状细胞层、上皮基底细胞层、前基质层、后基质层、内皮层的细胞密度分别为2150±315,5270±539,859±137,627±184,2529±654个/mm2,上皮基底细胞层下神经丛每幅图像中神经纤维总长度、神经纤维直径和数目、每100μm神经纤维包含的念珠状结构分别为944±176μm,2.3±0.5μm,9.0±1.3条,4.9±1.4;中后基质层神经每幅图像中神经纤维总长度、神经纤维直径和数目、每100μm神经纤维包含的念珠状结构分别为306±138μm,5.6±1.7μm,1.8±1.5条,0.0±0.0。上述计量和计数资料左、右眼和男、女之间无统计学差异。同时观察到排列疏松、细胞间夹杂有无结构暗区的表层上皮细胞层,过度形态的翼状上皮细胞层,呈“斑马皮样”外观的基底细胞层,在角膜中后基质层有4眼(18%)可见到微皱褶(microfolds),在排列规则、多呈六边型的角膜内皮层发现有2眼(9%)出现类似滴状赘疣(pseudoguttatalike)结构。结论:共焦显微镜可以在实时、活体和三维空间从细胞水平对角膜各层结构进行定量和定性分析。

【关键词】  角膜;显微镜检查;共聚焦;细胞;形态学

  In vivo morphologic characteristics of healthy old chinese cornea by confocal microscopy

  Jian Zhang, LiuHe Zou, Ying Li, Hang Li, Li Guo

  Foundation item: Outstanding Experts Foundation of Organization Department of Chinese Communist Party Beijing Committee (No.20051D0501821)

  1 Department of Ophthalmology, Xuanwu Hospital, Capital University of Medical Science, Beijing 100053, China;

  2 Tongren Ophthalmic Center, Beijing Tongren Affiliated Hospital, Capital University of Medical Science, Beijing 100730, China;

  3Department of Ophthalmology, Beijing Xiehe Hospital, Beijing 100730, China

  AbstractAIM: To investigate the cellular morphologic characteristics of healthy old chinese cornea by confocal microscopy in vivo. METHODS: Nineteen patients' (22 eyes) central cornea were examed by confocal microscopy in vivo. The cell densities of wing epithelial cell layer, basal epithelial cell layer, anterior stromal layer, posterior stromal layer and endothelial cell layer were counted. Nerve fibres' whole lenth, diametre, number of nerve fibres and beads number per 100μm nerve fibre in single clear picture in subbasal epithelial nerve plexus and in midposterior stromal nerve fiber were counted. The differences of these numerical datas between the left and the right eyes and between man's and women's eye were analyzed. Also, the morphologic characteristics of epithelial cell layer, stromal layer and endothelial cell layer were investigated.RESULTS: The cell densities of wing epithelial cell layer, basal epithelial cell layer, anterior stromal layer, posterior stromal layer and endothelial cell layer were 2150±315, 5270±539, 859±137, 627±184, and 2529±654 cells/mm2 respectively. The nerve fibres' whole lenth, diametre, number of nerve fibres and beads number per 100 m nerve fibre in single clear picture in subbasal epithelial nerve plexus were 944±176μm, 2.3±0.5μm, 9.0±1.3 pieces and 4.9±1.4 respectivley. The nerve fibres' whole lenth, diametre, number of nerve fibres and beads number per 100μm nerve fibre in single clear picture in midposterior stromal nerve fiber were 306±138μm, 5.6±1.7μm, 1.8±1.5 pieces, and 0.0±0.0 respectively. The differences of these numerical datas between the left and the right eyes and between man's and the women's eyes had no significance. The superfical epithelial cell layer appeared loosing arrangement with nostructure areas scattered. The wing epithelial cell layer showed cellular transition characteristics. The basal epithelial cell arrangement looked like "girrafe skin". CMTF images displayed microfolds (4 eyes) in the midposterior stromal layers and pseudoguttatalike changes (2 eyes) in the well arranged hexagon endothelial cell layer.
CONCLUSION: In vivo CMTF examination can offer qualitative and quantitative analysis in realtime and 3D condition to all layers of cornea in cellular level. It is a useful method to reveal corneal morphologic changes both physiologically and pathologically.
    KEYWORDS:cornea;microscopy;confocal;cell;
morphology

  0引言

    既往我们对人类角膜全层活体组织学的观察主要是应用裂隙灯,由于观察手段限制,我们只能看到放大40倍的影像,分辨率大概只能在30μm范围[1];自1990年共聚焦显微镜(confocal microscope through focus,CMTF)首次应用于对角膜组织的观察以来,研究者能够在无创、活体条件下观察角膜组织的病理变化,它具有高放大倍数及高分辨率等优点,其放大倍数可达1000倍,分辨率可达1μm,使我们能够活体、全层在细胞水平观察角膜的形态[2,3]。我们应用光学共聚焦显微镜观察了一组正常国人老年人中央角膜各层组织的形态,现报告如下。

  1材料和方法

  1.1材料

  200404/200501因年龄相关性白内障在首都医科大学宣武医院眼科15例18眼和首都医科大学附属同仁医院同仁眼科中心4例4眼行超声乳化白内障吸除术治疗的术前患者共19例22眼。男7例8眼,女12例14眼;左12眼,右10眼;年龄58~80(平均70.7±6.8)岁。观察对象均符合以下条件:患者身体健康,除外糖尿病、胶原血管病等影响正常角膜组织形态的全身病;除外角膜原有病变、葡萄膜炎、青光眼及眼外伤等眼前段病变和眼部手术史。眼轴22.0~25.0mm。Confoscan 2型CMTF机(日本Nidek公司),其主要装置:12V,100W的卤素光源和红外线、紫外线滤光器;40×0.75W∞/O水浸式物镜;机器自带CCD照相机和高速数码视频录像机;NAVIS软件处理系统(日本Nidek公司,3.4版)。

  1.2方法

  CMTF观察项目:CMTF检测均为同一操作者,图像分析由另一人承担。观察角膜中央上皮翼状细胞层、上皮基底细胞层、前基质层、后基质层、内皮层及上皮基底细胞层下神经丛(subbasal epithelial nerve plexus)和中后基质层神经(stromal nerves)的组织形态,同时记录中央角膜上皮翼状细胞层、上皮基底细胞层、前基质层、后基质层、内皮层的细胞密度,选取每个患者上皮基底细胞层下神经丛和中后基质层神经最清晰图像,并记录此幅图像中神经纤维总长度、神经纤维直径、神经纤维数目、每100μm神经纤维包含的念珠状结构数目(beads)。水浸式物镜放大倍数为1000倍,扫描范围340μm×255μm(0.0867mm2),景深8μm,侧向分辨率1~2μm,扫描频率20Hz,每次扫描可获得350幅图像,扫描厚度700μm,每次扫描过程获得4组往返扫描图像。选择半自动扫描;待检眼用4g/L盐酸奥布卡因表面麻醉1~2次;水浸式物镜表面加2g/L卡波姆眼用凝胶(美国BAUSCH & LOMB公司);将患者头部固定于显微镜架托上,钢丝开睑器开睑;嘱患者向正前方平视,移动物镜使其与角膜中央接近,待见至内皮层时按下记录键,则角膜各层的扫描图像被自动记录下来并存盘。应用NAVIS软件处理系统对观察到的形态学变化进行比较、分析。用ZScan软件系统记录所观察的结构在角膜内的深度。使用软件自带的细胞记数模块(The NAVIS Cell Count Window)手动对角膜上皮翼状细胞、上皮基底细胞、前基质细胞、后基质细胞和内皮细胞的细胞密度进行分析,其中角膜上皮翼状细胞密度分析时选择清晰的最靠近上皮基底细胞的翼状细胞图像,细胞数≥30;上皮基底细胞密度分析时选择清晰的靠近前弹力膜的基底细胞,细胞数≥50;前基质细胞密度分析时选择前弹力膜后方40μm范围内清晰的图像进行分析,细胞数≥30;后基质细胞密度分析时选择后弹力膜前方30μm范围内清晰的图像进行分析,细胞数≥30;内皮细胞密度分析时选择清晰的内皮层的完整图像进行手动计数,细胞数≥30;每一细胞密度数据测量3次(3次测量的图片为在同一次扫描检查中的4组往返扫描图像中位置基本相同的3张图片),取平均值。应用细胞记数模块对所需观察的结构之大小进行测量:选择角膜上皮基底细胞下和前弹力层之间最清晰的神经纤维丛图像以及中后基质层中包含最清晰的粗神经纤维图像,在100%放大倍率下,测量被选图像中(面积为:340μm×255μm=86700μm2)神经纤维总长度(μm);记录图像中神经纤维念珠状结构(beads)总数目,计算出神经纤维念珠状结构密度(念珠状结构数目/100μm),记录被选图像中神经纤维数目;将图像放大200%,测量神经纤维直径(μm)。
   
  统计学分析:用SPSS 11.0统计软件进行分析,P<0.05为有显著性意义。正态分布数据用均数±标准差(mean±SD)记录;计量及计数资料的不同眼别和不同性别之间统计学差异比较应用独立样本t检验,可信度为95%。

  2结果

  2.1老年人角膜特征  所有计量及计数资料数据均符合正态分布。翼状细胞层、上皮基底细胞层、前基质层、后基质层、内皮层的细胞密度值左右眼不同眼别比较差异无显著性(P>0.05);男女不同性别比较差异无显著性(P>0.05,表1)。中后基质层神经纤维无珠状结构。上皮基底细胞层下神经丛和中后基质层神经纤维总长度、神经纤维直径、念珠状结构密度和神经纤维数目值左右眼不同眼别比较差异无显著性(P>0.05);男女不同性别比较差异无显著性(P>0.05,表2~3)。表1  老年人角膜各层细胞密度(略)表2  老年人角膜上皮基底细胞层下神经纤维特征(略)表3  老年人角膜中后基质层神经纤维特征(略)

  2.2形态学观察

  2.2.1各层上皮细胞特点

  表层上皮细胞层呈多边圆或椭圆形,排列疏松,细胞直径35~50μm,反光强度不一,偶见强反光细胞;细胞核可见或不可见,直径约10μm,偶见高反光核仁;细胞边界呈高反光,细胞间夹杂有无结构暗区(图1A)。翼状上皮细胞层介于表层上皮细胞层和基底上皮细胞层之间的过渡细胞;细胞形态较规则,呈小圆形或多边圆形;细胞反光较表层上皮细胞均一,呈中等强度或暗反光;细胞大小介于上述两种细胞之间,越靠近基底细胞层直径越小;排列越紧密;细胞核明亮,直径5~10μm,位于细胞中央(图1B)。上皮基底细胞层为上皮细胞最底层细胞,细胞形态规则,呈小圆形,直径约10μm;排列规则,细胞为暗反光,细胞边界反光较强,呈“斑马皮样”外观,细胞核不见(图1C)。

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(来源:国际眼科杂志)(责编:zhanghui)

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