摘 要 目的和方法：用器官培养的方法在培养基中加入一定剂量的平阳霉素(pingyangmyc
in)作用于大鼠晶体而诱发形成白内障，并在白内障形成的早期过程中观察了晶体内非蛋白质巯基
(nonprotein sulfhydryl，NP-SH)、蛋白质巯基(protein sulfhydryl，P-SH)和二硫键(di
sulfide bond)，以及脂类过氧化水平(lipid peroxidation)的动态变化。结果和结论：培养
10min时，非蛋白质巯基首先下降;随后蛋白质巯基含量也开始降低;二硫键的含量至40min时才呈
现升高的趋势;而MDA在培养的初期无变化，30min后明显升高。
分类号 R776.1
The early changes of sulfhydryl，disulfide bond and the level of lip
id peroxide in rat lenses induced by pingyangmycin in vitro
Lu Aili...∥Ophthalmol CHN.-1999，8(3).-
158～161(Department of Biochemistry and Molecular Biology，Beijing Medical Uni
versity，Beijing 100083)
The method of tissue culture in vitro was used to study the cataractous
lenses of rats induced by pingyangmycin，and determined the content of NP-SH，P-SH，disulfide bond and the level of lipid peroxide.It was found that pingyangmycin could induce the cataractogenesis of rat lens in vitro;at cultured 10min，NP-SH began to decrease，and then followed by P-SH;disulfide had the tendency of rise at cultured 40min;and MDA was increased obviously after cultured 30min.
Subject terms Cataract;Organ culture;Lens，crystalline/metab
Edwards等[1](1975)首次报道了在用博莱霉素(bleomycin)治疗大鼠肿瘤过程中引起了晶体混浊。此后又成功地建立了博莱霉素白内障模型。国产平阳霉素的成分，主要为博莱霉素中的A5。本室于1987年经皮下注射平阳霉素已成功地建立了大鼠白内障模型[2]。我们利用晶体体外培养技术，在培养基中加入不同剂量的平阳霉素作用于大鼠晶体而诱发形成白内障，并且动态观察了在平阳霉素存在的情况下，大鼠晶体中NP-SH、P-SH、二硫键及脂类过氧化水平的变化，以期为进一步阐明白内障的发病机制及防治提供实验依据。
1 材料
1.1 动物 Wistar大鼠为北京医科大学实验动物部提供，体重80～100g，雌雄不限。
1.2 仪器 PU-8800紫外分光光度计，HITACHI F-3000荧光分光光度计。
1.3 试剂 组织培养199培养基为GibcoBRL公司产品，平阳霉素为天津河北制药厂，氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、5.5′二硫-(2硝基苯甲酸)(DTNB)、硼氢化纳、四甲氧基丙烷均为Sigma公司产品，其余均为国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 晶体组织培养
参照Schenck[3]方法略加改进：先将199培养基(含5%胎牛血清、100U/ml青霉素G及80μg/ml链霉素)置于24孔培养板孔内，37℃预保温30min，然后按无菌操作原则摘取大鼠晶体，仔细剔除虹膜及残留的玻璃体，用含青、链霉素的Hank液冲洗后，将晶体小心转入上述24孔培养板内，每孔放置一枚，后极朝下，于37℃、5%CO2条件下培养，两天后取出在倒置显微镜下观察，弃去剥取过程中损伤的晶体，将清亮透明晶体随机组合，并换无血清培养基培养待用。
2.2 白内障模型的诱发
在无血清199培养基中加入平阳霉素，其浓度参照文献[2]中整体实验药物注射的剂量而设定，从40mgL-1逐渐递减至10mgL-1。对照组仅为无血清199培养基。每48hr更换一次培养基。定期观察并记录晶体的混浊程度。晶体混浊程度参照Azuma等[4]的标准分为5级。(1)无混浊，晶体透明。(2)轻度混浊，晶体周边出现空泡。(3)中度混浊，晶体周边空泡向中心扩展，核出现雾状混浊。(4)高度混浊，空泡扩展到核区，核雾状混浊加重。(5)核混浊，成熟白内障。
2.3 晶体非蛋白质巯基、蛋白质巯基和不溶性蛋白质中二硫键含量的测定
按侯纬敏等[5]所用的方法测定。自给药后10、20、30、40min从培养基中分别取出晶体，吸干水分、称重后立即测定。并以同期未加药培养的正常晶体作对照。
2.4 脂类过氧化水平(MDA)的测定
采用Ohkawa[6]的方法，以脂类过氧化的代谢产物丙二醛(MDA)为测定指标而略加改进。按每克组织加入9ml 1.15%KCI液匀浆。于每管中依次加入10%匀浆液(W/V)0.2ml，8% SDS 0.2ml，20%醋酸1.5ml及0.8%硫代巴比妥酸1.5ml，最后用双蒸水将终体积调至4ml。于95℃水浴加热60min。取出待冷却后加入正丁醇与吡啶的混合液3.5ml(15∶1，V/V)，振摇提取有机层，于HITACHI F-3000荧光分光光度计测定荧光强度，激发光波长515nm，发射光波长553nm，以四甲氧基丙烷为标准，根据荧光强度大小计算MDA含量。
3 结果与讨论
3.1 白内障模型的诱发
我们选择了平阳霉素的四个浓度进行晶体培养，从培养第一天开始就在倒置显微镜下观察晶体的变化。由表1可见，24hr时，最低浓度(10mgL-1)培养的晶体仍清亮透明，而在其它浓度下培养的晶体都出现了Ⅱ～Ⅲ级不同程度的混浊;48hr后晶体混浊的程度逐步加重，至96hr时，所有含平阳霉素的培养基中的晶体全部出现了白内障。对照组晶体仍清亮透明，一般可存活两周以上。
表1 不同浓度平阳霉素晶体体外培养观察
平阳霉素浓度
(ml/L)混浊度不同培养时间(hr)
晶体混浊程度(%)
24487296
对照Ⅰ100.0100.0100.0100.0
10Ⅰ100.02.8
Ⅱ 93.56.9
Ⅲ 3.789.7
Ⅳ 3.4
Ⅴ 100.0
20Ⅰ
Ⅱ96.22.3
Ⅲ3.897.729.9
Ⅳ 70.1
Ⅴ 100.0
30Ⅰ
Ⅱ19.9
Ⅲ80.167.93.7
Ⅳ 32.178.0
Ⅴ 18.3100.0
40Ⅰ
Ⅱ2.5
Ⅲ97.537.2
Ⅳ 62.279.7
Ⅴ 0.620.3100.0
通过大鼠晶体体外培养的方法，建立白内障实验模型，是一种简便可靠的观察手段。在实验过程中，我们选择了既可以诱发白内障，但作用较轻缓的含10mgL-1平阳霉素培养基作为进一步实验的工作浓度。便于更好地动态观察测定指标的变化。
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