【摘要】 目的 对河北汉族一个四代先天性核性常染色体显性遗传白内障家系进行基因分析，了解此家系在候选基因上是否存在突变位点。方法 该家系22名成员(包括患者7人，非患者15人)知情同意进人本研究，并接受全面的眼部及全身检查，以排除白内障以及外眼部及全身疾患。该家系成员中患病者经眼部裂隙灯检查发现晶状体均为核性混浊。采集22名家系成员的外周静脉血，提取基因组DNA。选择国内外已报道的与先天性核性白内障发生相关的7个候选基因(CRYBA3/A1、CRYBB1、CRYBB2、CRYGD、GJA3、GJA8和MIP)，设计引物使聚合酶链反应扩增的片段覆盖候选基因外显子，对扩增产物进行测序和序列分析，寻找突变位点。结果 发现编码晶状体蛋白Βb1的基因(CRTBB1)第4外显子一个等位基因的第457个碱基发生错义突变C>A，形成杂合子，导致其编码蛋白第129位氨基酸由丝氨酸(S)转变为精氨酸(R)，其余外显子的碱基序列与GenBank数据库中的正常序列一致。结论 该家系的核性先天性白内障是由于CRYBB1基因外显子4的错义突变C>A引起。
【关键词】 先天性白内障;基因突变;CRYBB1
Missense mutation in the βB1-crystallin gene caused autosomal dominant congenital cataract in China
TANG Simeng*， ZHU Siquan*， LIN Dongxin， et al.
* Department of Ophthalmology， Beijing Tongren Hospital，Beijing China， 100005
[Abstract] Objective To observe the molecular characteristics of a four-generation Chinese pedigree with an autosomal dominant congenital cataract in Hebei province. Methods Twenty-two family members of the pedigree (including seven affected and fifteen normal individuals) agreed to participate in the study. The family members underwent ophthalmologic and general examinations to rule out any concomitant disorders. Blood samples were taken from the twenty-two family members. Candidate genes (CRYBA3/A1， CRYBB1， CRYBB2， CRYGD， GJA3， GJA8 and MIP) were PCR amplified and screened for mutations on both strands using direct sequencing. Results Sequencing of the coding regions and flanking intronic sequences of CRYBB1 showed the presence of a missense mutation that caused heterozygous transvertion (S129R) in exon 4. The change in S129R is predicted in the Beta crystallin “Greek key2” and would be expected to disrupt the three-dimensional structure of protein and β-crystallin interactions. Conclusion This is the first document of a mutation in beta crystallin that caused change in “Greek key2”. A missense mutation S129R of the CRYBB1 gene caused the autosomal dominant congenital nuclear cataract.
[Key words] congenital cataract; gene mutation; CRYBB1
先天性白内障(congenital cataract)是导致儿童失明和弱视的常见病因，发病率约为0.5%，占儿童致盲性眼病的第二位。先天性白内障致病因素中有1/3与遗传相关，遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁遗传三种类型，其中常染色体显性遗传最为多见。除此之外，先天性白内障还可表现为一些多系统缺陷综合征的一部分[1]。目前研究发现常染色体显性遗传的先天性白内障的发生与13个基因的变异有关，其中与核性白内障发生相关的有7个，这些基因包括晶状体蛋白基因(CRYBA3/A1[2]、CRYBB1[3]、CRYBB2[4]、CRYGD[5])、缝隙连接蛋白基因(GJA3、GJA8)[6]和内源性膜蛋白基因(MIP)[7]。我们针对上述与核性白内障发生高度相关的热点基因，对河北汉族一个4代先天性核性白内障家系的致病基因进行了鉴定。
1 资料和方法
1.1 临床资料 河北省一常染色体显性遗传先天性白内障家系。经眼部裂隙灯检查发现晶状体均为核性混浊(见图1)，且不伴有其他眼部及全身性疾病。在知情同意的前提下，采集22名家系成员的外周静脉血，绘系谱(见图2)。
1.2 方法
1.2.1 提取外周血细胞DNA 采集家族成员外周静脉血10 ml，加入EDTA抗凝。采用蛋白酶K-苯酚抽提法从外周血提取DNA，用紫外分光光度计定量后于4°C保存备用。
1.2.2 合成候选基因引物 合成CRYBA3/A1、CRYBB1、CRYGD、GJA3、GJA8及MIP基因所有外显子以及附近部分内含子的引物。其中CRYBB1、GJA3、MIP各外显子的引物序列为应用软件Primer 3在线设计，其余各基因外显子引物序列来自相关文献[3、8-9]，CRYBB1各外显子引物具体序列及片段长度见表1。引物长度在18～25 bp之间，引物由北京生物工程有限公司合成。
1.2.3 候选基因的PCR扩增 PCR反应总体积为25 ?滋l，包括缓冲液5 ?滋l，dNTPs 0.5 ?滋l，正向反向引物各0.3 ?滋l，Taq酶0.3 ?滋l，DNA模板2 ?滋l，MgCl2 在1.0~2.0之间。在Perkin Elmer 9600 PCR仪上进行反应，反应条件为：95℃ 2 min预变性，94℃ 30 s，53～62°C 45 s，72℃ 45 s，35个循环，72℃延伸7 min。
1.2.4 PCR产物测序 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，将家系中患者IV1以及家系中正常者III3的PCR扩增产物在ABI prism 3700 测序仪上进行测序，并将结果与GenBank中的正常序列进行比对分析。
1.2.5 验证基因突变致病性 在CRYBB1基因第4个外显子中发现一个错义突变后，扩增家系所有成员的CRYBB1基因第4个外显子进行测序。并用PCR-限制性片断长度多态性分析进行验证。根据突变位点设计限制性内切酶Hpy188Ⅲ位点，将家系成员第4个外显子扩增产物进行酶切处理后，发生突变的一条等位基因在内切酶的作用下，断裂成为两条较短的DNA片段(分别长约173 bp，186 bp)，而另一条未发生突变的等位基因DNA片段(长356 bp)内无酶切位点。在3%琼脂糖凝胶中电泳，患者显示2个条带(断裂形成的两条DNA片段长度相近，电泳无法分辨)，正常个体显示单一条带(见图3)。用酶切方法验证50个无血缘关系正常人的CRYBB1基因第4外显子。
2 结果
2.1 家系资料 在此家系中，所有患者均为双眼核性白内障，伴晶状体皮质轻度点状混浊，除晶状体核混浊程度不同外，形态完全一致，不伴有其他眼部疾患，无全身系统病变。四代家系中，每代均有患者，男女发病率无显著差异，判断此家系的先天性白内障为常染色体显性遗传。患者在幼儿期发现视力低下，并伴有眼球水平震颤。
2.2 CRYBB1基因突变分析 扩增CRYBA3/A1、CRYBB1、CRYBB2、CRYGD、GJA3、GJA8及MIP基因所有外显子，将IV1、III3号DNA模板的PCR产物测序，与正常序列相对比，发现CRYBB1基因第4个外显子中，一个等位基因的第457位碱基发生C>A碱基错义突变(见图4)，形成杂合子，导致其编码产物第129位氨基酸由丝氨酸(S)转变为精氨酸(R)(见图5)，其余外显子的碱基序列与GenBank数据库(NCBI35：22：25319196：25339194：-1)中的正常序列一致。扩增家系所有成员的CRYBB1基因第4个外显子进行测序，发现所有患者在同一位点均发生相同错义突变。根据突变位点设计内切酶，将第4个外显子进行酶切处理后，在3%琼脂糖凝胶中电泳，患者均显示2个条带，家系中正常个体及无血缘关系正常人显示单一条带。
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