作者：邢咏新，张林    作者单位：天津医科大学眼科临床医学院，天津市眼科医院，天津 300020

　　【摘要】  目的 研究刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)条件化培养基对体外培养的兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells, RCECs)生长的影响。方法 采用揭取后弹力层及内皮细胞联合组织块法进行RCECs的体外原代培养，分别用含有体积分数为5%、10%、15%、20% ConA的活化大鼠脾细胞条件上清液的RPMI 1640培养基进行RCECs原代培养，并用含10%(体积分数)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640培养基作为对照。神经烯醇化酶免疫组织化学染色法进行细胞鉴定；噻唑蓝比色法观察各组RCECs生长的状况；SPSS11.0 One-way ANOVA 及LSD检验进行统计分析。结果 成功进行了RCECs的体外培养，培养细胞内神经烯醇化酶阳性表达。ConA条件化培养基各组细胞增殖均高于对照组(P<0.001)，且10%、15% ConA条件化培养基组的RCECs细胞数量明显高于其他各实验组(P<0.001)。结论 ConA条件化培养基具有促进RCECs生长的作用，可作为培养辅佐剂。

　　【关键词】  角膜内皮细胞；原代培养；刀豆蛋白A；噻唑蓝；神经烯醇化酶

　　Effect of conditioned medium with concanavalin A-activated spleen cellssupernatant on cultured rabbit corneal endothelial

　　cellsXing Yongxin, Zhang Lin

　　1. Clinical College of Ophthalmology, Tianjin Medical University, Tianjin Eye Hospital, Tianjin 300020;

　　2. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China

　　ABSTRACT: Objective  To evaluate the effect of conditioned medium made up of ConA-activated spleen cells supernatant on cultured rabbit corneal endothelial cells (RCECs). Methods  RCECs were primarily cultured in vitro by revealing descemet membrane and endothelium combining tissues masses. Culture medium was RPMI 1640 with 10% FBS and varied concentrations of conA-activated spleen cells supernatant. Experimental groups were divided by different concentrations of ConA-conditioned supernatant: 5%, 10%, 15%, and 20%. In the control group only RPMI1640 and 10% FBS were used. Methyl thiazolyl tetrazolium colorimetry analysis was used to evaluate the proliferation of RCECs cellular population. The cultured cells were identified by immunohistochemical staining for neuronal specific enolase (NSE). Results  The RCECs were cultured successfully. RCECs presented positive expression in cytoplasm with NSE immunohistochemical assay. There were significant differences in the experimental groups compared with the control group (P<0.001). The effects were optimal in 15% and 20% groups. Conclusion  Conditioned medium with ConA-activated spleen cells supernatant can enhance proliferation of cultured RCECs, and thus can be used as adjutant in RCECs culture.

　　KEY WORDS: corneal endothelial cell; primary culture; Concanavalin A (ConA); methyl thiazolyl tetrazolium (MTT ); neuronal specific enolase (NSE)

　　角膜内皮细胞(corneal endothelial cells, CECs)是维持角膜透明性的重要结构。CECs病变引起的致盲性眼病已经成为危害人们尤其是老年患者健康的重要原因之一。近年来，组织工程角膜成为角膜移植领域的发展趋势。随着体外培养CECs的成功，CECs移植的研究逐渐由实验室走向临床。CECs在体外的增殖能力有限。许多学者在实验中使用了大量的生长因子，如碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生长因子(vascular epithelium growth factor, EGF)［1］等，这些生长因子虽然能够促进CECs的增殖，但是价格较高。因此寻找一种较为经济的促进CECs生长的辅佐剂，不但能够促进角膜内皮细胞研究的广泛开展，而且能在一定程度上节约组织工程角膜的成本。
   
　　刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)是一种植物凝集素，属于T细胞非特异性丝裂原。用ConA活化大鼠或小鼠脾细胞后的条件上清液中含有多种细胞因子，如白细胞介素(interleukin, IL)1、2、6、成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等［2］。在本研究中我们首次将ConA条件上清用于兔角膜内皮细胞(RCECs)的体外培养，观察其对细胞生长的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  眼球来源

　　健康成年新西兰白兔，雌雄不限，体重1.5-2.0 kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。动物耳缘静脉空气栓塞处死后立即取出眼球，在无菌条件下，剪除眼球周围结缔组织及球结膜，生理盐水(含庆大霉素400 u/mL)冲洗后并浸泡其中，置于4 ℃冰箱备用。

　　1.2  主要试剂及溶液配制

　　①主要试剂：RPMI 1640培养基，美国GIBCO公司；ConA，美国SIGMA公司；IMDM(iscove’s modified dulbecco’s medium)培养基，美国GIBICO公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，杭州四季青生物制品公司；胰蛋白酶，美国GIBCO公司；L-谷氨酰胺，美国SIGMA公司；噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)，美国SIGMA公司；兔抗人神经烯醇化酶抗体(neuronal specific enolase, NSE，美国SIGMA公司)及DAB显色试剂盒(美国VECTOR公司)由西安交通大学医学院第二附属医院病理科提供。②ConA活化脾细胞上清液制备：将大鼠脾脏制成单细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用IMDM培养基调整细胞密度至5×106/mL。移入24孔细胞培养板内，每孔2 mL，加入ConA 10 μL(100 μg/mL)，置于5%(体积分数)CO2培养箱内孵育；培养48 h，取出培养上清液，1 000 r/min离心10 min，通过葡聚糖凝胶G-25(sephadex G-25，SIGMA)过柱，过滤除菌(0.22 μm)，分装，-20 ℃储存备用。使用前加入0.1 mol/L的a-甲基甘露糖(a-methylmannoside, SIGMA)以中和上清液中残留的ConA成分。本实验中ConA条件上清液由第四军医大学空医系细胞培养室提供。③条件化培养基制备：每100 mL RPMI 1640培养基中分别加入5、10、15、20 mL ConA条件化上清液，10 mL FBS，60 mL IMDM液，青霉素100 u/mL，链霉素100 mg/L。

　　1.3  主要仪器设备
 
　　CO2培养箱(日本TOABAI ESPEC公司BNA-321D型)；倒置相差显微镜(美国BAUSCH LOMB公司)；医用超净化工作台(苏州净化设备厂)；高速离心机(北京医用离心机厂)；酶联免疫检测仪(第四军医大学空医系细胞培养室)

　　1.4  RCECs的体外培养

　　1.4.1  RCECs的原代培养

　　采用后弹力层及内皮层揭取联合组织块法。在超净工作台内，将上述备用眼球置于无菌培养皿D-Hanks液中，在体视解剖显微镜下，于角膜缘内1 mm 360°环形剪取角膜片，置于另一无菌培养皿中，内皮面向上；沿角膜片边缘揭取内皮细胞层，内皮面向上。将其切割成1 mm×2 mm大小的组织块，置于以0.02 g/L明胶及FBS预处理的无菌培养瓶中，内皮面向下；铺平展开组织块，放入37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中贴壁4 h后，分别加入各组培养基，置于培养箱中继续孵育；72 h后首次更换培养液，以后每隔2 d换液一次。

　　1.4.2  RCECs的传代培养

　　细胞生长接近融合期进行传代。倾去原培养液，以D-Hanks液清洗，加入2.5 g/L胰蛋白酶1 mL，于37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中消化3-5 min，迅速置于倒置显微镜下观察；见细胞胞体回缩，细胞变圆，即加入体积分数为10%或15% FBS的RPMI 1640培养基终止消化；以毛细吸管反复轻轻吹打后，将细胞悬液注入5 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清；注入新鲜培养液，充分混匀后，以8×104/mL-1×105/mL密度分别接种于24孔培养板中，置于37 ℃，5%(体积分数)CO2培养箱中继续孵育；细胞贴壁后常规换液，待细胞汇合，同法传代。

　　1.5  细胞鉴定

　　1.5.1  标本制作

　　将5 mm×5 mm盖玻片常规清洗、泡酸、消毒后，置于24孔培养板内，以0.02 g/L明胶溶液预处理，于超净工作台内紫外线照射2 h后备用。培养瓶中细胞消化后，将2代细胞以1×104/L密度传代至放有盖玻片的24孔培养板中，置于37 ℃、5%(体积分数) CO2培养箱中孵育48 h后取出，以0.01 mol/L PBS溶液冲洗3次，冷丙酮(4 ℃)固定15 min，0.01 mol/L PBS溶液冲洗3次，室温下干燥后封存，于-35 ℃冰箱保存备用。

　　1.5.2  NSE免疫细胞化学鉴定

　　0.01 mol/L PBS溶液清洗已固定的细胞爬片3次。于细胞爬片上滴加0.75%(体积分数)H2O2-PBS溶液［30%(体积分数)H2O2 1 mL+0.01 mol/L PBS 80 mL］，37 ℃恒温孵育30 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS振洗3次；滴加0.3%(体积分数)Triton X-100溶液，室温孵育30 min，PBS振洗3次；滴加正常羊血清封闭液，37 ℃恒温箱孵育30 min，甩去多余液体；滴加1∶100 NSE，4 ℃冰箱过夜，次日37 ℃复温60 min，PBS振洗3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃恒温温箱孵育30 min，PBS振洗3次；滴加SABC复合物，室温孵育30 min，0.01 mol/L PBS溶液清洗4次，PBS振洗3次；最后使用DAB显色试剂盒显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。用PBS替代一抗孵育，设立阴性对照。结果观察：细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性表达。

　　1.6  MTT比色法测定不同浓度ConA条件化培养基对兔角膜内皮细胞生长的影响

　　原代细胞汇合后，以8×104-1×105/mL密度传代至96孔板，取96孔板中20孔，分为5组，每组4孔。各组分别加入不同浓度ConA(5%、10%、15%、20%)条件化RPMI 1640培养基(含10% FBS)，并设立对照组，培养5 d。5 d后换液加入180 μL培养液并加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，吸去培养液；加入200 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使板底的紫蓝色结晶充分溶解，用仅加入200 μL二甲基亚砜的孔作为空白对照。酶联免疫检测仪490 nm测定吸光度值(A值)，每孔测3次保证结果稳定性。

　　1.7  统计学处理

　　采用SPSS for Windows 11.0软件录入数据并进行One-way ANOVA及LSD检验，设定P<0.05为差异有统计学意义。

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