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2 结果
2.1 角膜缘干细胞原代培养与鉴定 相差显微镜下观察，在羊膜上培养24 h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞爬出（图1），大多为圆形、透明状。之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8 d细胞形成单层膜状（图2），细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主。若继续培养至14 d左右，细胞成复层生长。
2.2 采用免疫荧光法鉴定原代培养的干细胞 AE5抗体染色阳性细胞质呈红色，阴性则不着色（图3）；p63抗体染色阳性细胞核呈绿色（图4）。羊膜上培养7 d的细胞AE5抗体阳性细胞比例为（41.72±11.35）%，p63抗体染色阳性细胞比例为（21.57±6.36）%。具体见表1。
2.3 传代纯化的角膜缘干细胞鉴定 经传代培养，与组织块原代培养时相比，相差显微镜下观察细胞形态较规整，成纤维状细胞明显减少（图5）。经免疫荧光鉴定，2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05），AE5阳性细胞数明显减少（图6），p63阳性细胞数增多（图7）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。见表1。 表1 原代与传代角膜缘干细胞免疫荧光染色结果比较
3 讨论
组织工程化角膜是解决角膜移植供体来源最有前途的一个方法。载体是构建组织工程化角膜上皮的关键环节，合适的载体应可以促进体外角膜缘干细胞的生长，同时又便于培养的细胞移植。羊膜为胎盘最内层的半透明组织，研究表明，其作为角膜缘干细胞体外培养的载体并用于移植有许多优点：①能为正常角膜上皮生长、移行创造良好的条件。羊膜是人体中最厚的基底膜，含有高浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)和糖蛋白，有利于上皮细胞的分化、移行，并能加强基底上皮细胞的附着和防止上皮细胞凋亡。②免疫原性弱。羊膜不含HLAA、B、C及DR等抗原成分，移植后不被宿主排斥，且在体内可降解［２］。③移植后可以阻止结膜化的发生。羊膜可诱导转化生长因子（TGF）β等细胞因子在创伤愈合中与成纤维细胞活动有关的信号下调，从而达到抗纤维化效果，减轻瘢痕形成。其中，TGFβ3还是干细胞生长的重要因子。④具有抗微生物特性，因此可降低移植术后感染的发生率。⑤羊膜还具有活跃的物质转运功能，能允许一些小分子物质如尿素、葡萄糖等通过。⑥羊膜来源广泛，制备成本低。以上特点使羊膜被认为是工程化角膜上皮的最佳载体［3］。本课题组采用去除上皮细胞的新鲜羊膜作为载体培养角膜缘干细胞，与其他文献报道相比，细胞生长速度较快，24 h即可见有细胞长出，7～8 d汇合成单层膜状。这可能与所用羊膜均为取材后12 h内，与干细胞生长相关细胞因子含量丰富有关。
目前对角膜缘干细胞标志物的研究已取得了一定的进展，但仍然缺乏具有特异性的标志物。Schermer等［４］的研究表明，K3蛋白是角膜上皮终末分化的标志性角蛋白，未表达K3是角膜缘干细胞的标志之一。Pellegrini等［５］证实角膜缘基底细胞抗p63抗体阳性，其他部位均阴性；能形成全克隆的细胞是干细胞，而全克隆细胞p63抗体阳性，故认为p63是角膜上皮干细胞的特异标志之一［６］。所以我们采用AE5抗体（K3抗体）和p63抗体行免疫荧光鉴定所培养细胞。本实验原代培养7 d羊膜上的细胞膜片中AE5阴性细胞较多，说明角膜缘组织块原代培养可获得维持于低分化状态的干细胞；而p63阳性细胞较多则说明细胞增殖能力很强。以新鲜羊膜为载体采用组织块法培养角膜缘组织可得到含角膜缘干细胞的细胞膜片。3代AE5阴性细胞和p63阳性细胞比例明显高于原代。
但是实验过程中发现，角膜缘组织原代细胞中混杂有成纤维状细胞和其他分化成熟的细胞，且增殖速度高于角膜缘干细胞，培养超过2周则载体全被成纤维状细胞覆盖。因不同细胞贴壁程度不同，因此我们利用不同的消化时间将培养细胞传代克隆化，尽量去除成纤维状和其他杂细胞。结果表明，夹杂于干细胞间的成纤维状细胞明显减少。而且在本实验条件下，原代细胞浓度为1×105copies/ml传代，3代AE5阴性细胞和p63阳性细胞比例最多，角膜缘干细胞纯度最高。但传代超过4代，角膜缘干细胞大部分同时表达AE5和p63，说明干细胞已经出现分化。
【参考文献】
［1］ 韩晓洁,龚岚,余振钰,等.人角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定［J］.解剖科学进展,2005，11(1)：13.
［２］ Schwab IR.Cultured corneal epithelia for ocular surface disease［J］.Trans Am Ophthalmol Soc, 1999, 9(7): 891986.
［3］ 夏凉,赵敏.角膜缘干细胞培养的载体研究概况及进展［J］.中国实用眼科杂志,2005,23(12):12651268.
［4］ Schermer A, Galvin S, Sun TT．Differentiationrelated expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells［J］．J Cell Biol, 1986, 103(1): 4962.
［5］ Pellegrini G, Dellambra E, Golisano O,et al.p63 identifies keratinocyte stem cells［Ｊ］．PNAS，2001，98：31563161.
［6］ Du YQ．Functional reconstruction of rabbit corneal epithelium by human limbal cells cultured on amniotic membrane［Ｊ］．Molecular Vision，2003，9：635643. 上一页 [1] [2] |
