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1.2.3.3 病毒感染及TCID50/ml滴定病毒感染及滴定在25×50 mm方瓶中、单层MEK细胞上进行，以细胞病变（cytopathic effect,CPE）作为病毒感染指标，每瓶细胞加不同稀释度病毒2 ml，每个稀释度接种4瓶细胞，室温吸附1.5 h后，弃去病毒液，加入维持液，33℃孵育，逐日观察CPE出现情况，滴度按Behrens-Kaerber方法计算，以TCID50/ml表示。
1.2.3.4 柳叶提取液对MEK细胞的毒性实验采用柳叶提取原液、柳叶提取原液1/2浓度、柳叶提取原液1/4浓度3种浓度，分别加入到细胞中，在28℃不同时间，观察对细胞生长的影响。
1.2.3.5 柳叶提液抗EV70作用为了确定柳叶提取液的抗病毒作用，采用病毒感染细胞的前60 min给药，感染细胞90 min后给药，病毒与药物同时加入到细胞中等不同的途径给药进行观察，观察细胞出现CPE的情况。
2 结果
2.1 EV70（AHC/J670/71）TCID50滴定经实验计算，该毒株LgTID50/ml为7.76；图中A~D显示EV70在MEK单层细胞中繁殖生长，产生CPE情况。见图1。
a正常细胞对照，b~d分别为毒株感染（10-5）24、48、72 h细胞出现CPE情况
图1 EV70（AHC/J670/71）在MEK单层细胞中繁殖产生CPE情况（略）
2.2 柳叶提取液对MEK细胞的毒性表1显示MEK细胞在3种不同浓度柳叶提取液作用下，不同时间的细胞生长情况。结果表明：原浓度在细胞中作用60 min内，细胞无明显损伤。当原药浓度在细胞中作用90 min，80%以上细胞的生长形态发生不可逆改变，细胞变圆、肿大、折光性增加、最后裂解。柳叶提取液对MEK细胞的最大无毒浓度为1/4原药浓度。见图2。
a正常对照； b、c药物作用30，60 min
图2 柳叶药物原液对MEK细胞生长的影响（略）
表1 不同浓度药物对MEK细胞生长的影响（略）
―为无损伤 +为无明显损伤 ++为不可逆改变的损伤
2.3 柳叶提取液的抗EV70作用实验中我们采用了EV70感染细胞的同时给药，攻击病毒量为100TCID50，给药物组细胞出现细胞病变的时间比无药对照组后延48～24 h，结果表明，在感染的同时用药，显示了对EV70的明显抑制作用，与对照组比较，用药组出现CPE的时间后延（当接种病毒量为1000TCID50/ml时，CPE出现延时12～24 h），CPE程度明显减弱，细胞存活率提高，通过活细胞计数发现，当无药对照组100%细胞出现CPE时，药物组产生CPE的细胞不到30%。见图3。
a、b为加药组； c、d为无药对照； b、d为a、c的4倍放大照片
图3 药物+EV7010-5在试管内作用于1 h后，加入到细胞吸附1.5 h后，换维持液33℃孵育52 h时的结果（略）
2.4 柳叶病毒作用效果观察固定柳叶提取原液浓度，观察不同浓度病毒抑制作用，结果表明，病毒攻击量低于或等于1000TCID50时，在48 h时，滴定柳叶提液组的病毒滴度比无柳叶提取液对照组降低了1.5～1.0 个对数单位，同时观察到，病毒稀释度愈高，柳叶液的抑制效果愈强，其细胞CPE程度弱，时间后延48～24 h，活细胞百分离增大。
3 讨论
柳叶主要含有水杨苷、碘、邻苯二酚、鞣质［1，2］等物质，其生理活性为协同作用，通过实验建立柳叶中邻苯二酚定性、定量的方法，仅作为柳叶或制剂质量标准的一项指标。制止病毒吸附，干扰病毒侵害细胞，是寻找抗病毒药物的一种途径［4，5］。实验结果表明，柳叶提取液对EV70有明显抑制作用［3］，在阻实验条件下细胞无毒性。在本实验中，当病毒感染细胞的同时加药，表现出较好的抑制效果。当药物浓度不变时，随着病毒感染剂量的减少，药物的抑制作用愈强，细胞病变出现时间明显后延，活细胞百分离增大，这也证实了柳叶提取液直接抗病毒作用。
参考文献：
［1］ 国家药典委员会，中国药典，Ⅱ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录VIB.
［2］ 冉先德.中华药海，上卷［M］.哈尔滨：哈尔滨出版社，1993：56.
［3］ 陈 娟，黄祥瑞.柳叶1号药物抗EV70作用的体外效果观察［J］.军事医学科学院院刊，1993，23（1）：22.
［4］ De Clercq E.Chemotherapwutic approaches to the treatment of the AIDS［J］.J Med Chem,1986,29:1561.
［5］ Ishituka H,Ninomiya Y,Suhara Y.Molecular basis of drug resistance to new antirhinovirovirus agents［J］.J Antmicro Chemother ,1986,29:1561 上一页 [1] [2] |
