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3讨论
活性氧自由基作为导致角膜内皮细胞损伤的主要因素之一，与电光性眼炎、角膜的碱烧伤等多种疾病也密切相关[1,13]。利用天然抗氧化药物抑制活性氧自由基所引起的损伤，已成为治疗角膜疾病及提高角膜移植手术成功率的重要途径。已有研究表明，活性氧自由基引发的细胞凋亡主要由线粒体介导而启动，主要包括胱冬肽酶依赖性途径和胱冬肽酶非依赖性途径[810]。细胞凋亡后，常常出现形态皱缩、脱落、膜通透性改变和出现DNA断片化等凋亡特征，这些特征的出现与否已经成为鉴定细胞是否凋亡的主要证据[8]，而AO/EB双染色中细胞核是否为橙红色以及DNA在电泳中是否出现梯状条带也已成为判定细胞凋亡的重要依据[14,15]。据报道，一些黄酮类化合物对由H2O2引起的细胞凋亡均具有抑制作用[3,4]。但到目前为止，有关黄酮对HCEC的抗氧化保护作用及其作用机制仍不清楚。我们的主要目的就是揭示黄酮对HCEC氧化损伤的保护作用及其机制，为因氧化损伤所致HCEC凋亡的预防和治疗奠定理论基础。
H2O2是一种常见的活性氧，极易透过细胞膜形成高活性氧自由基，因其性质相对稳定、易获得，故已成为研究细胞氧化损伤的重要模型[16]。我们利用不同浓度H2O2对人角膜内皮细胞（HCEC）处理的结果发现，400～800μmol/L H2O2处理组HCEC，在光镜下均出现了皱缩与脱落现象，在吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染色中出现了橙红色荧光（细胞凋亡率分别约为30%，60%和65%），在琼脂糖凝胶电泳中除400μmol/L H2O2处理组外均出现了DNA梯状条带（即DNA断片化），证明HCEC确实发生了细胞凋亡，只是400μmol/L H2O2处理组HCEC的细胞凋亡程度很小。为了确定黄酮对HCEC的抗氧化保护作用，我们选用600μmol/L H2O2对HCEC处理8h建立了体外培养HCEC的H2O2氧化损伤模型。在上述HCEC的H2O2氧化损伤模型中，在用600μmol/L H2O2进行凋亡诱导处理前先使用70μmol/L黄酮对HCEC进行了30min预处理的研究结果显示，黄酮预处理组HCEC仅少数细胞发生细胞凋亡，没有出现DNA梯状条带，细胞凋亡率由60%降至8%，而仅用黄酮处理组的HCEC凋亡率仅为1%。证明70μmol/L的黄酮对600μmol/L H2O2引起的HCEC凋亡具有显著的抑制作用，即对HCEC具有很强的抗氧化保护作用。
H2O2和/或黄酮处理组HCEC中总CytC和AIF浓度的ELISA检测结果显示，600μmol/L H2O2诱导HCEC发生细胞凋亡的过程中，伴随有总CytC和AIF浓度的增加，处理3h后总CytC的峰值浓度约为对照组的7.97倍，处理6h后总AIF的峰值浓度约为对照组的1.28倍，而黄酮预处理H2O2再处理组HCEC以及仅用黄酮处理组HCEC的总CytC和AIF浓度与对照组之间没有显著差异。表明H2O2处理HCEC确实引起了其线粒体中CytC和AIF的释放，而70μmol/L黄酮预处理对H2O2诱导HCEC线粒体中CytC和AIF的释放具有强烈的抑制作用。H2O2处理引起HCEC线粒体中CytC和AIF释放的结果证实，600μmol/L H2O2诱导HCEC凋亡的机制很可能是通过提高线粒体通透性转变孔的通透性进而释放出CytC和AIF来启动细胞凋亡程序的，与H2O2对肠上皮细胞的损伤机制是一致的[17]。
图4黄酮和/或H2O2处理8h后HCEC的变化 （光学显微镜×100; AO/EB双染色×400) （略）
A,B：未经黄酮或H2O2处理；C,D：70μmol/L黄酮；E,F：70μmol/L黄酮预处理，600μmol/L H2O2再处理
表3黄酮和/或H2O2处理组HCEC中CytC浓度的变化（略）
表4黄酮和/或H2O2处理组HCEC中AIF浓度的变化（略）
600μmol/L H2O2处理后，HCEC中总CytC浓度迅速大幅度升高，总CytC浓度升高的时间不仅早于AIF，而且升高的幅度也远远大于AIF，且7h后CytC浓度剧烈下降，说明CytC的释放是个比较早期的事件，暗示CytC可能在H2O2诱导HCEC凋亡的早期启动阶段具有重要作用。这可能与CytC仅在细胞凋亡的启动阶段发挥作用且持续时间较短有关[18]。
黄酮预处理对H2O2处理引起HCEC线粒体中CytC和AIF释放的影响结果证实，黄酮对H2O2诱导HCEC发生细胞凋亡的抗氧化保护作用的机制很可能是通过降低线粒体内的活性氧水平，抑制MPTP的开放进而阻止CytC和AIF外流来实现的。该结论与人脐静脉内皮细胞和肝细胞经H2O2或甘氨鹅去氧胆酸（glycochenodeoxycholic acid）处理后CytC和AIF从线粒体上释放至胞浆，而环孢霉素A (cyclosporin A)，维生素E和β胡萝卜素可抑制线粒体中CytC和AIF的泄漏从而抑制细胞凋亡的研究结论是一致的[19,20]。
图5黄酮和/或H2O2处理HCEC的DNA电泳图谱（略）
M，DL2000 marker；A：未经黄酮或H2O2处理；B：70μmol/L黄酮；C：70μmol/L黄酮预处理，600μmol/L H2O2再处理
我们首次研究了人角膜内皮细胞氧化损伤及黄酮抗氧化保护作用的机制，为利用黄酮预防和治疗因氧化损伤而引起的HCEC凋亡提供出了理论依据，对于早日攻克HCEC凋亡所致角膜病、实现其临床治疗也具有重要的理论意义和应用价值。目前，正在进行黄酮对HCEC线粒体中活性氧水平的影响作用及其机制研究。
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