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图1正常组小鼠未见明显突破视网膜的内皮细胞核HE×400；（略）
图2高氧组见大量突破视网膜内界膜的内皮细胞核HE×400；（略）
图3PBS对照组见大量突破视网膜内界膜的内皮细胞核HE×400；（略）
图4GM6001组见少量突破视网膜内界膜的内皮细胞核HE×400；（略）
图5正常组小鼠视网膜各层均见大量PEDF的表达，以神经节细胞层和神经纤维层为著，玻璃体后界膜也可见表达；（略）
图6高氧组小鼠PEDF的表达视网膜各层均很微弱在神经节细胞层和神经纤维层也仅有少量表达；（略）
图7PBS对照组小鼠PEDF的表达视网膜各层均很微弱；（略）
图8GM6001组，小鼠视网膜各层均见大量PEDF的表达，以神经节细胞层和神经纤维层为著在外核层表达也很明显；（略）
图9CD31阳性表达为棕黄色颗粒正常组小鼠未见明显突破视网膜内界膜的新生血管；（略）
图10CD31阳性表达为棕黄色颗粒高氧组小鼠见大量突破视网膜内界膜的新生血管；（略）
图11CD31阳性表达为棕黄色颗粒PBS对照组小鼠见大量突破视网膜内界膜的新生血管；（略）
图12CD31阳性表达为棕黄色颗粒GM6001组小鼠见少量突破视网膜内界膜的新生血管（略）
1.2.2 ELISA检测结果 MMP2，MMP9，PEDF的含量GM6001组和PBS对照组及高氧组之间在统计学上均有差异P＜0.01
表1ELISA检测结果（略）
GM6001组和正常组之间没有统计学差异P＞0.05，高氧组和PBS对照组没有统计学差异P＞0.05（表1）。
3讨论
多种眼部疾病与新生血管的形成有重要关系，例如早产儿视网膜病变（ROP），老年性黄斑病变，增生性玻璃体视网膜病变，新生血管性青光眼等，由于手术过程中对眼部组织不可避免的损伤而使多种眼病的疗效欠佳，寻求一种有效的治疗新生血管的非手术疗法成为了当前研究的热点。为研究视网膜新生血管的治疗，我们选择了目前应用最广的模型是氧致小鼠视网膜新生血管动物模型。小鼠模型新生血管发生率为100%且可重复性好。以往的研究表明同一母鼠连续5d置于750mL/L氧浓度环境中，在第4～5d时母鼠容易因氧中毒导致肺病变而死亡。为此本实验在SPF级实验室中进行，对氧箱进行密封，在使氧箱浓度达到750mL/L后将氧流量调至最低，并从通氧第2d开始每天使母鼠在正常氧环境中生活6h左右，并在氧仓内应用干燥剂碱石灰，这样母鼠从未死亡，实验周期大大缩短。
多种因子参与了眼部新生血管的形成。其中色素上皮衍生因子是一种抑制新生血管形成的关键因子，色素上皮衍生因子由RPE细胞分泌[2]进入感光细胞间质，被认为是玻璃体和角膜中没有血管的主要原因[3]。在早产儿视网膜病变（ROP）的动物模型中，玻璃体腔内注射PEDF可以抑制视网膜新生血管的形成[4]。在ROP模型中，小鼠视网膜各层PEDF的表达在高氧环境中是逐渐升高的，离开高氧环境进入正常氧环境中时PEDF的表达逐渐降低[5]。随着PEDF的降低在第17d时有大量突破视网膜内界膜的新生血管形成。低氧被认为是PEDF降低的主要原因。Notari等[6]发现在低氧环境中（基质金属蛋白酶2）MMP2和MMP9（基质金属蛋白酶9）能够降解PEDF。基质金属蛋白酶可以降解细胞外基质的多种成分其中包括PEDF但不包括VEGF（血管内皮生长因子）。MMP2和MMP9是小鼠玻璃体腔内存在的两种主要的MMPS。我们通过实验证实在高氧组和PBS对照组中MMP2和MMP9的表达明显高于正常组和GM6001组。GM6001组和对照组相比PEDF的含量明显升高，而新生血管的数量明显降低。从而证实了在ROP模型中视网膜组织中PEDF的降低和MMP9及MMP2的表达升高有关。在以往的研究中发现玻璃体腔内注射小剂量的PEDF对新生血管的形成没有明显的抑制作用而大剂量的PEDF对新生血管的形成有明显的抑制作用[7]，我们的研究认为小剂量的PEDF对新生血管没有明显的抑制作用的原因可能是因为MMP2和MMP9对PEDF的降解。这提示在临床上MMPS抑制剂和PEDF的联合应用会取得更好的疗效。
我们曾在实验中通过免疫组化发现高氧组和对照组小鼠在第12d刚从高氧环境中取出时玻璃体腔内血管不明显，然而在第17d时发现玻璃体腔内有大量的新生血管的形成，这部分血管大部分在视网膜的周边部，其中部分血管应是视网膜血管在脱水过程中脱离到玻璃体腔内的,但我们未计数这部分新生血管内皮细胞。
GM6001是一种新型的广谱的MMPS抑制剂，是已知作用最强的人工合成的MMPS抑制剂，对MMP2和MMP9均有强大的抑制作用。基质金属蛋白酶促进视网膜新生血管的形成主要体现在以下3个方面：(1)降解细胞外基质有利于新生血管的出芽；(2)与VEGF协同作用促进VEGF的表达[8]；(3)可以降解PEDF。所以抑制了MMPS的表达就从以上3个方面抑制了新生血管的形成。新的研究认为MMP2对PEDF的降解是PH值依赖性的，在PH值是7.4时只是把PEDF降解为46kDa没有活性的PEDF[9],我们实验所用的抗体均是针对50kDa的PEDF，没有对46kDa的PEDF做进一步的研究。目前MMPS抑制剂已经成为了一种抑制新生血管形成的有效的药物，成为了治疗老年性黄斑病变的一种新疗法[10,11]，并且在应用了MMPS抑制剂后PEDF的表达升高。
总之，玻璃体腔内注射GM6001后和对照组相比MMP2,MMP9的表达降低，而PEDF的表达升高。PEDF和MMPS在新生血管形成中均发挥重要作用，二者之间的相互作用具有至关重要的作用。因为MMPS对PEDF的降解，所以在临床上，PEDF和MMPS 的联合应用具有重要的意义。
【参考文献】
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3 TombranTink J, Barnstable CJ. PEDF. a multifaceted neurotrophic factor. Nat Rev Neurosci2003;4:628636
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6 Notari L, Miller A, Martinez A, et al. Pigment EpitheliumDerived Factor Is a Substrate for Matrix Metalloproteinase Type 2 and Type 9: Implications for Downregulation in Hypoxia. Invest Ophthalmol Vis Sci2005;46:27362747
7张淑莲,石文静,陈超.色素上皮衍生因子对新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用.中华围产医学杂志 2006;9(6):381384
8聂晓怡,陈盛举,金婉蓉,等.基质金属蛋白酶抑制剂对视网膜新生血管化抑制作用的实验研究.眼科研究 2001;6:511514
9史庆成,宁建华.基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对大鼠角膜碱烧伤后新生血管的抑制作用.国际眼科杂志 2008;8(3):496498
10 Holz FG, Miller DW. Pharmacological therapy for agerelated macular degeneration: current developments and perspectives. Ophthalmologe2003;100:97103
11赵平,于华军.基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在糖尿病小鼠视网膜组织中的表达.国际眼科杂志 2004;4(4):610614 上一页 [1] [2] |
