【摘要】目的：原代分离培养SD大鼠Müller细胞，在实验室建立Müller细胞株。
方法：采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Müller细胞，免疫组化法进行鉴定。
结果：原代培养的Müller细胞胞体狭长，胞浆丰富，经过3～5次传代后逐渐变得胞体宽大，出现微丝和突起。免疫组化显示，95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性。
结论：改良的酶消化法是培养视网膜Müller细胞的简单有效的方法。
【关键词】 培养; Müller细胞
Primary culture of SpragueDawley rat müller cells
YongDong Chen, Xun Xu, Qing Gu
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China
Abstract
AIM: To culture müller cell and established cell strain in our laboratory.
METHODS: The retina was obtained from neonate rat and müller cells were isolated by Modified enzyme digestion. The cultured müller cell was identified by immuocytochemistry, and was observed under inverse phase microscope.
RESULTS: The cultured müller cell had large cell body and abundant kytoplasm. The body became wider and microfilament and cytodendrite appeared after 35 passage. More than 95% of the cells were positive stained for the glutamine synthetase.
CONCLUSION: The modified enzyme digestion method is a simple and effective way for culturing müller cells.
KEYWORDS: culture; Müller cell
0引言
Müller细胞是众多视网膜胶质细胞中的一种, 它能维持视网膜的正常代谢,调节神经成分和血管成分之间相互作用； 在病理状态下，其异常活化与许多视网膜变性、缺血性疾病有着密切关系[1,2]。为了研究Müller细胞在体外的病理生理特点，原代培养Müller细胞是必不可少的手段。我们的目的就是在实验室建立SD鼠的Müller细胞株，为深入研究奠定基础。
1材料和方法
1.1材料 DF12培养基(Hyclone) , 100g/L胎牛血清(GIBCO) ,胰蛋白酶(Sigma) ,鼠尾胶(自制) ,山羊抗鼠谷氨酰胺合成酶抗体(Sigma) 。
1.2方法 将出生5～7d的SD 大鼠麻醉处死,摘除眼球,移入超净台,在庆大霉素中浸泡10～20s 后生理盐水冲洗,重复3次，在解剖显微镜下去除眼前节,剥取视网膜。将视网膜剪碎,并用2.5g/L胰蛋白酶消化5min ,Hanks液终止消化,反复吹打细胞制成细胞悬液,经400目筛网过滤后离心800r/min ,5min 后弃上清。用DF12 培养液(含100g/L胎牛血清100KU/L 青霉素10KU/L 庆大霉素) 调整细胞浓度为3×105/mL,接种于包被有鼠尾胶的塑料培养瓶内,于37℃，50mL/L CO2 培养箱内培养。48h 后, 轻轻吹打后去除未贴壁的细胞，换液。待细胞铺平融合后，采用李树林等[3]介绍的酶消化法去除Müller细胞以外的其他细胞类型，待细胞形态一致后，以1∶2方式进行传代。预先在培养皿中置入盖玻片,待细胞贴壁融合后将上述传至3～5代的细胞盖玻片取出,TBS浸润，乙酸及丙酮混合液固定10min，30mL/L H2O2 封闭内源性过氧化物酶,非免疫动物血清白蛋白封闭10min，ABC 法进行GS染色，一抗稀释度为1∶100，PBS代替一抗做为阴性对照，DAB显色，棕黄色为阳性显色。
2结果
培养24h后,部分细胞团贴壁后,可向周围进行细胞迁移,在第5～7d后,细胞形成融合状态。经第一次换液时轻柔吹打，以及融合后用低浓度胰酶反复消化并吸除悬浮细胞后，细胞形态趋于一致，为胞体狭长，胞浆丰富，核圆形或椭圆形（图1A）。3～4代后，细胞变得扁平，胞体宽大，胞浆内出现微丝（图1B）。选取3～4 代的细胞进GS染色,阳性细胞在95 %以上(图2A，B) 。
3讨论
视网膜含有多种细胞成份，因此，要将其中的Müller细胞分离出来是很关键的步骤，以往的文献报道采用改进的酶消化法[2]和恒温震荡法[4]均能有效的实现Müller细胞的分离，具体方法是在培养皿中预先铺上鼠尾胶，然后前者是采用恒温摇床振荡分离，后者是采用反复低浓度胰酶消化后去除悬浮细胞，其原理都是利用Müller细胞较其他细胞容易贴壁的特点。本实验采用改进的酶消化法，经过低浓度胰酶消化后将悬浮的细胞杂质去除，并重复2～3次，得到了满意的分离效果。证明了改进的酶消化法确实是一种简单有效的分离Müller细胞的方法。以往文献报道多采用神经胶质酸性蛋白（GFAP）来鉴定Müller细胞，但新的研究显示，GFAP并非Müller细胞的特异性标志物，因为，其他两种视网膜胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）也能表达GFAP,并且有学者观察到，体外分离培养的人视网膜Müller细胞并不表达GFAP。因此, 用GFAP来鉴定Müller细胞的方法尚存在争议，而谷氨酰胺合成酶是Müller细胞所特有[5]，因此，在鉴定Müller细胞的步骤，我们采用了谷氨酰胺合成酶抗体，其阳性率在95%以上。
图1Müller细胞(倒置显微镜×100) （略）
A:融合时原代培养;B:传4代后
图2A:培养的Müller细胞免疫组化阴性对照（SABC ×200）;B:谷氨酰胺合成酶表达阳性（SABC ×200）（略）
【参考文献】
1 Bringmanna A, Pannickeb T, Groscheb J, et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retinal Eye Res2006;25:397424
2刘晓娟,惠延年,郭斌,等.缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响.国际眼科杂志 2007;7:395399
3李树宁，王诤华，白海青,等.改进的酶消化法培养新生大鼠的Müller细胞.眼科研究2005;23:155157
4 苟琳,张作明,许汉鹏,等.恒温摇动法纯化培养大鼠视网膜Müller细胞的技术研究.眼科研究2002;20:411413
5 Arroyo JG, Ghazvini S, Char DH. An immunocytochemical study of isolated human retinal Müller tells in culture. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol1997;235(7):411414 |
