【摘要】目的：通过研究内源性大麻素物质（anandamine，AEA），对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、黏附以及迁移功能的影响，探讨AEA降低眼压的机制。
方法：对牛眼小梁细胞进行体外原代培养及传代培养，应用免疫组化的方法（NES，Ⅷ因子相关抗原染色）鉴定细胞，化学及透射电镜观察。对3代牛眼小梁细胞分别以含AEA 10，1，0.1，0μmol/L DMEM(含100ml/L小牛血清)培养液进行干预，分别于24,2h,2h后用MTT法计数细胞，再利用计算机统计软件进行数据分析，观察其对牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能的影响。
结果：内源性大麻素，在一定浓度范围内，对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能均有较为明显的抑制作用（P＜0.05）。
结论：由此，可以了解到AEA可能是通过影响小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能来改变房水流出途径的阻力，而降低眼内压。
【关键词】 牛眼小梁细胞；内源性大麻素；纤维连接蛋白；原发性开角型青光眼
Effect of AEA on proliferation, adherence and immigration in cultured bovine trabecular cells
XiaoGang Yang, DeXiu Zhang, SiWei Liu, Li Chen, SongLin Sun
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM: To study the effect of endogenous cannabinoid (Anandamine, AEA) on proliferation, adherence and immigration in cultured bovine trabecular cells (BTCs) and to investigate the mechanism of AEA on the degrading intraocular tension.
METHODS: BTCs were primarily cultured and subcultured, detected by NES and observed under TEM. The third passage cells were incubated with different dosages of AEA (10μmol/L, 1μmol/L, 0.1μmol/L, 0μmol/L, final concentration, diluted by DMEM) for 24, 2 and 2 hours. The number of BTCs was counted with MTT method. Then the results were analyzed by the computer dataanalysis system and statistical test.
RESULTS: AEA inhibits the proliferation, adherence and immigration in BTCs, in comparison and control group(P<0.05).
CONCLUSION: On this data, AEA possibly degrades intraocular tension through affecting the outflow in trabecular meshwork.
KEYWORDS: bovine trabecular cell; anandamine AEA; fibronectin; primary open angle glaucoma
0引言
原发性开角型青光眼（primary openangle glaucoma，POAG）是全世界常见的致盲眼病之一，目前的治疗方案仍然存在争论。但为了控制患者的眼压，以求达到靶眼压，人们一直在找寻一种经济适用的药物来控制眼压水平。POAG的发生和小梁细胞的生物学功能的改变有着密不可分的关系。研究小梁细胞在药物作用下的增殖、粘附以及迁移功能的改变对研究POAG的发病机制和治疗方法都具有重要的临床意义。自从1971年Helper等发现吸食大麻素可以降低25%～30％的眼压后，人们对大麻素在抗青光眼方面的作用做了很多研究，如Kumar等［1］的研究曾提示，大麻素对小梁细胞的生物学功能有不同程度的影响。我们通过研究内源性大麻素物质（anandamine，AEA），N花生四氢酸氨基乙醇对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、粘附和迁移的影响，试图对大麻素的降眼压机制进行一些有益的探索。
1材料和方法
1.1材料 取附近屠宰场现杀新鲜牛眼。牛眼符合下列条件：全部为小牛眼，牛龄小于24mo,以保证小梁细胞培养的成活率，剜取牛眼时如有眼球破裂及眼内炎症则全部废弃，以减少污染机会。 将牛眼置于有冰袋的保温桶中，迅速运回实验室。DMEM高糖培养基购自Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青公司。胰蛋白酶、EDTA和大麻素购自Sigma公司。纤维连结蛋白购自CHMICON公司。Transwell购自COSTAR公司。MTT试剂由西安交通大学提供。
图1体外培养的牛眼小梁细胞原代至3代的形态（略）
A：为体外培养的原代细胞；B：为体外培养的1代细胞；C：为体外培养的2代细胞；D：为体外培养的3代细胞
1.2方法 牛眼小梁细胞培养参考杨新光等［2］的方法并加以改进。小梁细胞游离组织块后，每周换液2 次。 待细胞长满瓶底后用1.25g/L 的胰蛋白酶和0.2g/LEDTA 消化传代。取第2代的小梁细胞接种于预置盖玻片的培养皿， 待细胞贴壁2d后用0.01mol/L PBS液清洗3次，40g/L的多聚甲醛固定，行NSE、vimentin 及ⅧR：Ag 免疫组化染色。另取细胞铺片，用4℃预冷的20g/L 戊二醛固定，交电镜室透射电镜标本制备。
1.2.1测定AEA对牛眼小梁细胞增殖的影响 取三代牛眼小梁细胞接种于96孔培养板，接种密度约为3×104个/孔。分组加入含AEA 10，1，0.1，0μmol/L DMEM(含100g/L小牛血清)培养液，至于37℃细胞培养箱中孵育24h后取出。用MTT法检测不同浓度 AEA对牛眼小梁细胞增殖的影响。
1.2.2测定AEA对牛眼小梁细胞粘附功能的影响 取三代牛眼小梁细胞接种于以10mg/L fibronectin预先包被的96孔培养板，接种密度约为3×104个/孔。分组加入AEA 10，1，0.1，0μmol/L DMEM无血清培养液，置于37℃细胞培养箱中孵养2h取出。用MTT法检测不同浓度AEA对牛眼小梁细胞黏附功能的影响。
1.2.3测定AEA对牛眼小梁细胞迁移能力的影响 取三代牛眼小梁细胞制成不含血清的DMEM细胞悬液，置于24孔Transwell的上方小室内（1×108个/L），不同浓度组分别含有AEA 10，1，0.1，0μmol/L。下方小室加入含 fibronectin 20mg/L的DMEM完全培养液。置于37℃细胞培养箱中孵养2h，取出。用MTT法检测不同浓度AEA对牛眼小梁细胞迁移能力的影响状况。
2结果
培养细胞的形态学观察牛眼小梁细胞原代培养5～8d 细胞由组织块向外生长， 原代细胞形态差异较大，呈圆形，梭形，多角形。细胞轮廓清，折光性较强。细胞核圆，胞质颗粒多。传代接种细胞数为4×107个/L，24h左右贴壁。传至3代的小梁细胞有稳定的形态结构。细胞胞质丰富，颗粒较多，细胞可见胞突和分支。 融合后细胞呈扁平上皮样，胞核呈卵圆形。由于原代牛眼小梁细胞对胰蛋白酶敏感，采用1.25g/L 胰蛋白酶和0.2g/LEDTA 消化细胞，并按1∶1 对原代细胞传代。细胞生长良好的， 第1 代细胞可按1∶2或者1∶3 向后传代。透射电镜见细胞胞质丰富，富含核糖体、线粒体和高尔基复合体，有较多空泡。核膜周围可见微丝。核膜双层，核周异染色质明显，核仁明显，可见双核仁。小梁细胞NSE 染色阳性，vimentin 染色阳性，ⅧR：Ag 色阴性。 证实了小梁细胞是神经外胚层神经嵴间充质来源。 结果与吴琼等[3]相同。综上所述，从培养细胞的生长过程、 形态学观察和免疫组化特性上证明，所培养的细胞即为小梁细胞(图1)。AEA对牛眼小梁细胞增殖功能的影响（表1）; AEA对牛眼小梁细胞粘附能力的影响结果（表2）;AEA对牛眼小梁细胞迁移能的影响结果（表3）。
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