【摘要】目的：研究卡巴胆碱对人视网膜色素上皮细胞株D407表达及分泌转化生长因子β2（transforming growth factor β2 , TGFβ2）的影响。
方法：常规培养D407细胞，分为实验组，加入卡巴胆碱108～104mol/L；空白组：不加药物。处理后2，4，8，16，24，48h采用ELISA法检测上清液中TGFβ2的含量，分析时效与量效关系；采用细胞免疫化学法检测卡巴胆碱孵育24h后D407细胞TGFβ2蛋白质的表达，运用图像分析软件ImagePro Plus 6.0行半定量分析。统计学方法采用单因素方差分析。
结果：空白组细胞上清液中TGFβ2含量于培养4h后开始上升，24h达586.9±28.5ng/L，各时间点比较有统计学意义（F=86.59,P<0.01)。实验组细胞上清液中TGFβ2含量较空白组增加，随孵育时间的延长该效应逐渐明显，各浓度(108～104mol/L)组内比较均有统计学意义（F=65.21, 183.52,237.07,250.08,344.40; P<0.01)；各干预时间点（2，4，8，16，24，48h）实验组细胞上清液中TGFβ2含量随卡巴胆碱浓度升高逐渐增加，组内比较均有统计学意义（F=191.19,293.32,444.26,473.21,315.83,329.08; P<0.01)。孵育24h后实验组D407细胞TGFβ2蛋白质的表达较空白组增高（F=26.11，P<0.01）。
结论：卡巴胆碱可促进人视网膜色素上皮细胞分泌TGFβ2。
【关键词】 卡巴胆碱；视网膜色素上皮细胞；转化生长因子β2；细胞因子
The regulation of carbachol on TGFβ2 autocrine of D407 human retinal pigment epithelial cells
Jia Tan, ShuangZhen Liu
Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
Correspondence to: ShuangZhen Liu. Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To investigate the regulation of carbachol on the expression and secretion of transforming growth factor β2 (TGFβ2) of D407 human retinal pigment epithelial cells.METHODS: D407 cells were cultured conventionally and divided into two groups. One group was incubated with carbachol (108104mol/L) as experimental group, the other was untreated as blank group. The level of TGFβ2 secretion induced by carbachol was measured by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) at 2, 4, 8, 16, 24 and 48 hours after D407 cells were treated, and the time and doseeffect relations were explored. The level of TGFβ2 protein expression was detected by immunocyto chemistry after D407 cells were incubated with carbachol of different concentrations for 24 hours, and the semiquantitative analysis was carried out by using ImagePro Plus 6.0. The data were analyzed by means of analysis of variance (ANOVA).RESULTS: In blank group, the level of TGFβ2 in the supernate was increased after 4 hours of incubation, and reached 586.9±28.5ng/L at 24 hours. There was a significant difference in the level of TGFβ2 at various time points (F=86.59, P<0.01). In experimental group, the level of TGFβ2 in the supernate was higher than that in the blank group, and this effect was more significant when the incubation time was longer or the concentration of carbachol was higher. There were significant differences among the groups of different concentrations (108104mol/L) (F=65.21,183.52,237.07, 250.08, 344.40; P<0.01) and among the groups at different time points (at 2,4,8,16,24,48 hours)(F=191.19,293.32,444.26,473.21,315.83,329.08; P<0.01). The expression of TGFβ2 protein of D407 cells in experimental group was higher than that in blank group (F=26.11; P<0.01).
CONCLUSION: Carbachol might be involved in the regulation of the cytokine network in the retinaretinal pigment epitheliumchoroid complex by promoting the autocrine function of human retinal pigment epithelial cells.
KEYWORDS: carbachol; retinal pigment epithelium; transforming growth factor β2; cytokine
引言
多年以来关于近视眼的发病机制研究主要集中在视网膜和巩膜。在信号从视网膜传递至巩膜的过程中，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）起着不可忽视的作用。RPE具有自分泌功能，可分泌多种细胞因子和生长因子，并有多种受体表达［1,2］。因此RPE可接收来自视网膜的信号，阻断其生物学效应下传；亦可产生下一级信号分子作用于脉络膜和巩膜。其自分泌的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、转化生长因子β2（transforming growth factor β2, TGFβ2）被认为是调控近视眼巩膜基质重塑的关键信号分子［3］。同时，临床研究发现阿托品在近视眼治疗方面疗效确切［4,5］。阿托品为非特异性M受体拮抗剂，其本身并无生物学活性，表现出的效应为取消M受体激动剂的作用所致。因此，可以认为，视网膜、脉络膜组织中内源性乙酰胆碱（acetylcholine, Ach）为致近视发生的相关信号分子。既往研究表明，阿托品治疗近视的靶点既非睫状肌［6］，亦非视网膜无长突细胞［7］，因此Ach是否可调控RPE自分泌功能成为寻找阿托品作用靶点的关键切入点。我们通过体外培养人RPE细胞株D407，予胆碱能M受体激动剂卡巴胆碱进行干预，观察RPE细胞表达及分泌TGFβ2的变化，旨在探讨胆碱能药物对RPE细胞自分泌功能的调控，并为揭示近视眼的发病机制及阿托品治疗近视的机理提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料
人RPE细胞株D407、小牛血清、青霉素和链霉素、胰蛋白酶和EDTA均由中南大学湘雅医学院细胞中心提供，DMEM培养基、广谱无血清培养基添加物购自美国Gibco公司，卡巴胆碱（carbachol）购自美国CalBiochem公司，人TGFβ2 ELISA试剂盒购自Bender MedSystems 公司，TGFβ2多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，SP9000免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。
1.2方法
取生长良好的D407传代细胞，按每孔3×105个细胞接种于6孔板中，常规DMEM培养，次日细胞贴壁生长后更换无血清培养基（SFM）培养24h，分为实验组，加入卡巴胆碱108～104mol/L作用2，4，8，16，24，48h；空白组，不加药物，仅作换液处理。
1.2.1 D407细胞上清液中TGFβ2含量的检测
于干预时间点收集各组细胞培养液，1500g离心15～20min后取上清，20℃保存。具体操作参照Bender公司说明书进行，酶标仪450nm（参考波长630nm）处读取A值，绘制标准曲线（图1），计算各时间点细胞TGFβ2的分泌量。
1.2.2 D407细胞TGFβ2的表达的检测
取生长良好的RPE传代细胞，按每孔5×104个细胞接种于预置消毒载玻片的24孔板中，常规DMEM培养，次日细胞贴壁生长后更换无血清培养基（SFM）培养24h，按照实验分组加入各浓度卡巴胆碱，作用24h后以40g/L多聚甲醛固定30min孵育。按照试剂盒提供步骤行标本染色。阴性对照组用PBS代替一抗。DAB显色，中性树胶封片，显微镜观察。胞质呈棕黄色染色者为TGFβ2蛋白表达阳性细胞。采用图像分析软件ImagePro Plus 6.0测定单位面积中免疫组化反应阳性颗粒平均吸光度（A），数据以±s表示。
统计学处理：采用SPSS11.0软件包对实验数据行正态性检验、方差齐性分析及单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2结果
2.1 D407细胞上清液中TGFβ2含量
上清液中TGFβ2含量随培养时间延长逐渐升高（F=86.59, P<0.01, 表1,图2,3)。TGFβ2含量于培养4h后开始上升，24h达586.9±28.5ng/L，48h为570.4±28.2ng/L，24和48h比较无统计学差异（P>0.05）。108～104mol/L卡巴胆碱均可刺激D407细胞TGFβ2分泌增加，并随孵育时间延长逐渐升高（F=65.21,183.52,237.07,250.08,344.40；P<0.01，表1，图2）。两两比较发现，各浓度卡巴胆碱孵育24h细胞上清液中TGFβ2含量均达到峰值，孵育48hTGFβ2含量与24h相比无统计学差异（P>0.05）。各时间点随卡巴胆碱浓度升高，细胞上清液中TGFβ2含量逐渐升高（F=191.19,293.32,444.26,473.21,315.83,329.08;P<0.01.表1，图3）。两两比较发现，卡巴胆碱浓度达106mol/L时，促进细胞自分泌TGFβ2的效应达到最大，浓度继续升高时，除作用2h细胞上清液中TGFβ2含量轻度下降，其余各时间点差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2 D407细胞TGFβ2的表达水平
空白组培养24h后D407细胞胞质中TGFβ2蛋白呈阳性表达（图4），经图像分析软件ImagePro Plus 6.0测定A值为152.1±7.6；卡巴胆碱干预24h后，TGFβ2蛋白表达水平随卡巴胆碱浓度增加而上升，其A值依次为165.8±4.9（108mol/L），182.2±5.7（107mol/L），190.6±11.1（106mol/L），187.0±5.9（105mol/L），183.0±5.4（104mol/L）；各组差异具有统计学意义（F=26.11; P<0.01）。卡巴胆碱浓度为107～104mol/L时胞质中TGFβ2蛋白表达水平无统计学差异（P>0.05）。表1 D407细胞上清液中TGFβ2含量变化（略）
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