【摘要】目的：探讨地塞米松对大鼠晶状体上皮细胞增殖与分化的影响以及异常增殖与分化在激素性白内障形成中的作用。
方法：对大鼠晶状体上皮细胞进行原代培养，应用不同浓度的地塞米松作用于2代上皮细胞24h，采用MTT方法检测地塞米松对上皮细胞增殖的影响，采用RTPCR和Western blotting方法，在转录及蛋白水平检测晶状体上皮细胞分化标志蛋白（β晶状体蛋白）表达的变化，了解地塞米松对上皮细胞分化的影响。
结果：地塞米松在一定范围内对晶状体上皮细胞有促进增殖的作用，其增殖率分别为108mol/L组131.9%，107mol/L组142.5%，106mol/L组183.4%；地塞米松在转录及蛋白水平可降低晶状体上皮细胞中β晶状体蛋白的表达，在转录水平的表达分别为对照组2.07±0.26，108mol/L组1.48±0.07，107mol/L组1.06±0.16，106mol/L组0.78±0.16，在蛋白水平的表达分别为对照组1.38±0.16，108mol/L组1.07±0.11，107mol/L组0.97±0.04，106mol/L组0.62±0.12，说明地塞米松对晶状体上皮细胞的分化有抑制作用。
结论：地塞米松对晶状体上皮细胞促进增殖和抑制分化的作用可能在激素性白内障形成机制中有一定的作用。
【关键词】 地塞米松；激素性白内障；晶状体上皮细胞；增殖；分化
Effect of dexamethasone on proliferation and differentiation of rat lens epithelial cells in vitro
Hua Xin Chen, Lei Yang,DuanLian Zhang
1Department of Ophthalmology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command of Chinese PLA, Wuhan 430070, Hubei Province, China;
2Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
Correspondence to: Lei Yang. Department of Ophthalmology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command of Chinese PLA, Wuhan 430070, Hubei Province, hina. [email protected]
AbstractAIM: To assess the effect of dexamethasone on proliferation and differentiation of rat lens epithelial cells
in vitro and to investigate the mechanism of gluco corticoid induced cataract.METHODS: Primary rat lens epithelial cells (rLECs) cultures were used throughout this study. The second generation rLECs were exposed to different concen trations of dexamethasone for 24 hours. Proliferation feature of rLECs was detected with MTT assay. RTPCR and Western blotting were applied to identify the expression of βcrystallin, specific marker of lens epithelial cells differentiation, at protein and transcription levels.RESULTS: Dexamethasone induced proliferation of rLECs in certain scope. The rate of proliferation was 131.9% (108mol/L group), 142.5% (107mol/L group) and 183.4% (106mol/L group) respectively. rLECs treated by dexamethasone showed a decline inβcrystallin expression at protein and transcription levels. The expression of βcrystallin mRNA was 2.07±0.26 (control group), 1.84±0.07 (108mol/L group), 1.06±0.16 (107mol/L group), and 0.78±0.16 (106mol/L group) at transcription level. The expression of βcrystallin was 1.38±0.16 (control group), 1.07±0.11 (108mol/L group), 0.97±0.04 (107mol/L group), and 0.62±0.12 (106mol/L group) at protein level.It showed that dexamethasone had inhibitive effects on differentiation of lenspithelialcells.CONCLUSION:Proliferation enhancement and differ entiation inhibitionof dexamethasonetreated lens epithelial cells may play an important role in the develop ment of glucocorticoid induced cataract.
KEYWORDS: dexamethasone; glucocorticoid induced cataract; lens epithelial cells; proliferation; differentiation
引言
长期应用糖皮质激素可以引起激素性白内障（glucocorticoid induced cataract, GIC），其特征是后囊下混浊（posterior subcapsular opacities，PSO），随着激素在器官移植、免疫性疾病以及创伤救治等方面的大量应用，GIC对视功能的影响已引起人们的重视。有关GIC的发病机制有许多假说，但PSO的形成机制仍不清楚。近来提出的细胞增殖、分化异常学说认为，激素可影响眼内生长因子（如bFGF，TGFβ）的合成与释放，或直接作用于晶状体上皮细胞，使得晶状体上皮细胞的增殖与分化发生异常，赤道部的晶状体上皮细胞不能正常分化为晶状体纤维细胞，因而继续增殖并移行至晶状体后囊区，导致细胞堆集，形成激素性PSO。尽管该学说在阐明PSO形成方面较其它假说更合理，但缺乏实验支持，我们拟通过地塞米松（dexamethasone，Dex）对大鼠晶状体上皮细胞（rat lens epithelial cell，rLEC）增殖与分化影响的初步研究，探讨晶状体上皮细胞增殖与分化异常在GIC发病机制，特别是PSO形成过程中的作用。
1材料和方法
1.1材料
健康SD大鼠来自广州军区武汉总医院实验动物中心，鼠龄2mo，体质量180～210g，雌雄不限；高糖DMEM（美国Corning），胎牛血清FBS（中国医学科学院生物工程研究所），Dex（美国Sigma），MTT（北京华美生物），Tripure试剂（瑞士Roche），RTPCR试剂盒（日本Takara），兔来源的β晶状体蛋白多克隆抗体（美国Santa Cruz），PCR仪、凝胶成像仪和酶标仪（美国Biorad），多功能电泳仪（美国Biorad），高速低温离心机（德国Heraeus），核酸蛋白分析仪(美国Beckman)。PCR引物根据β晶状体蛋白mRNA序列（NM012937）设计，内参引物根据GAPDH mRNA序列（NM002046）设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。
1.2方法
常规无菌条件下，取新鲜大鼠晶状体前囊膜组织，采用组织块培养法，即将组织剪碎后，放入25mL培养瓶中，加入培养液（高糖DMEM+200mL/L FBS），倒置放入37℃、50mL/L CO2孵箱中，6h后放倒培养瓶，1wk后每3d换液1次，细胞融合后用2.5g/L胰酶消化，按1∶2传代。
1.2.1 Dex对rLEC增殖的测定
消化第2代细胞，以含FBS的DMEM调整细胞悬液密度至108/L，接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液200μL，共20孔，置37℃、50mL/L CO2孵箱中培养至细胞贴壁，弃培养液，加入无血清DMEM 200μL，同样条件下继续培养2h进行同步化，弃培养液，加入含Dex的DMEM 200μL，终浓度分别为0（对照组），108，107，106mol/L，每组5个复孔，另设一组5孔作为空白组以消除培养液的吸光值，同样条件继续培养24h后，每孔加入5g/L MTT 20μL继续培养6h，弃培养液，每孔加入DMSO（二甲亚砜）200μL，振荡10min后，以酶标仪在490nm处测吸光度值A。计算细胞增殖率（%）=（Dex组平均A值/对照组平均A值）×100%。
1.2.2 β晶状体蛋白mRNA的RTPCR反应
消化第2代细胞，调整细胞密度至107/L，接种于6孔培养板中，每孔加入1mL细胞悬液，于37℃，50mL/L CO2条件下培养至80%融合，弃培养液，加入含Dex的DMEM 1mL，终浓度分别为0（对照组），108，107，106mol/L，每组3个复孔，同样条件下继续培养24h后，弃上清液，0.01mol/L PBS清洗3次，利用Tripure抽提细胞中总RNA，测吸光值（260nm/280nm）均在1.8～2.0间，提示RNA纯度理想，RNA浓度为280～340mg/L；取总RNA 1μg，分别加入MgCl2 2μL，10×RT Buffer 1μL，dNTP Mixture 1μL，RNase Inhibitor 0.25μL，AMV逆转录酶 0.5μL，OligodT 0.5μL，补足去离子水，配制成10μL反应体系；经30℃反应10min，42℃反应30min，99℃反应5min，5℃反应5min后，得到RT产物；取RT产物1μL作为模板，分别加入5×PCR Buffer 5μL，Taq酶0.125μL，上、下游引物各1μL，去离子水16.875μL，配制成25μL反应体系；先经变性94℃ 5min，再通过变性94℃ 30s，退火（βcrystallin 59.8℃，GAPDH 58℃）30s，延伸72℃ 45s，循环35次，最后再延伸72℃ 10min，得到PCR产物；各取PCR产物7μL，经15g/L琼脂糖凝胶电泳（80V，1h），凝胶成像仪摄片，利用其自带的Quantity One软件测量目的条带吸光度值A，以GAPDH吸光度值作为标准对比。
1.2.3 Western blotting检测
消化第2代细胞，调整细胞密度至107/L，接种于6孔培养板中，每孔加入1mL细胞悬液，于37℃，50mL/L CO2条件下培养至80%融合，弃培养液，加入含Dex的DMEM 1mL，终浓度分别为0（对照组），108，107，106mol/L，每组3个复孔，同样条件下继续培养24h后，弃上清液，0.01mol/L PBS清洗3次，加入细胞裂解液（TrisEDTANaCl）0.3mL作用30min，刮取细胞，移入1.5mL离心管中，超声破碎2min，置冰盒裂解1h，离心10min（4℃，18000g），取上清液测蛋白浓度；取蛋白样品50μg加入上样缓冲液中煮沸2min，加样至90g/L SDSPAGE进行凝胶电泳（125V，1h），半干转至硝酸纤维素膜上（125mA，1h），将膜放入封闭液中，4℃下放置3h，室温下1h，加入一抗（βcrystallin抗体，1∶200），室温下1h，4℃过夜，TBST洗脱，加入二抗（羊抗兔IgG，1∶1500），室温下90min，洗膜后加发光试剂反应5min，X线胶片曝光3min，显影、定影并扫描胶片，利用Quantity One软件测量目的条带吸光度值A。以GAPDH（上海康成）吸光度值作为标准对比。
统计学处理：所有实验均重复3次，所得数据用SPSS8.0处理，以±s表示，组间采用Onway ANOVA法，两两比较采用LSD法，设定显著性水平P=0.05。
2结果
2.1 Dex对rLEC的增殖作用
Dex对rLEC有促进增殖的作用（P<0.05），其中107mol/L和108mol/L两组的增殖作用无明显差别(A:0.456±0.050,142.5%vs0.587±0.091,183.4%，P>0.05)，106mol/L组增殖作用最强（A:0.422±0.050,131.9% vs0.320 ± 0.058,100.0%）,提示在一定范围内，高浓度的Dex较低浓度的Dex对rLEC的增殖作用强。
2.2 RTPCR结果
每组RT产物可扩增出两个目的条带，一条为288bp的β晶状体蛋白，一条为392bp的GAPDH ，rLEC在不同Dex浓度作用下，β晶状体蛋白mRNA的表达情况见图1。随着Dex浓度增加，β晶状体蛋白mRNA的表达逐渐降低，GAPDH在各组表达无差异（P>0.05）；计算吸光度比值（βcrystallin/GAPDH）作为β晶状体蛋白mRNA的相对表达量，分别为0mol/L组2.07±0.26，108mol/L组1.48±0.07，107mol/L组1.06±0.16，106mol/L组0.78±0.16，组间两两比较，差异均显著（P<0.05），提示Dex可抑制β晶状体蛋白mRNA的表达，并在一定范围内与Dex浓度呈正相关（图2）。
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