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NF-κB活性对TNF-α调节小梁细胞表达MMP-3和MMP-9影响

http://www.cnophol.com 2008-12-25 11:11:10 中华眼科在线

   【摘要】  目的 探讨核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是否参与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)调节人眼小梁细胞(human trabecular cells,HTCs)表达基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases-3,MMP-3)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的过程。方法 采用 RT-PCR法和酶谱分析法(zymography)检测体外培养的人眼小梁细胞经0 ng/ml(对照组)、1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml TNF-α处理24 h后,细胞表达MMP-3、MMP-9的量;运用NF-κB的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶(pyrrolidine dithocarba-mate,PDTC)抑制NF-κB的活化,观察TNF-α对体外培养的HTCs MMP-3,MMP-9表达影响的改变。结果 运用RT-PCR法和酶谱分析法研究均发现经浓度为1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml的TNF-α处理的细胞在mRNA和上清液中活性蛋白水平均能增加MMP-3、MMP-9的表达,各组mRNA/β-actin吸光度比值和条带酶解量与对照组相比差异均有显著性(P<0.05)。提前30 min加入PDTC,MMP-3、MMP-9的表达量分别较未加入PDTC组表达量明显减少,差异有显著性(P<0.05)。结论 TNF-α可上调MMP-3及MMP-9的表达,PDTC能够下调TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达,因此推测NF-κB可能参与MMP-3和 MMP-9转录的启动。

   【关键词】  细胞培养 小梁细胞 肿瘤坏死因子-α 基质金属蛋白酶 核因子-κB

    原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是一种慢性进行性前部视神经病变,伴有典型的视神经凹陷、萎缩及视野缺损,房角是开放的。然而迄今为止,其病因及发病机制尚不清楚。许多研究发现POAG患者小梁网中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)异常堆积,房水流出阻力增加。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类金属依赖性的蛋白水解酶家族,是降解细胞外基质主要的酶。激光小梁成形术(laser trabeculoplasty,LTP)是治疗POAG的一种有效的方法,术后发现房水的流出率增加,同时房水中的肿瘤坏死因子-α(tumor necrotil factor-α,TNF-α)分泌增加,推测两者之间存在相关性,即激光小梁成形术可能通过诱导增加细胞因子TNF-α分泌来增加小梁的MMPs家族,尤其是MMP-3及MMP-9的表达。核因子-κB(nuclera facotr-κB,NF-κB)是一种可快速对外界刺激做出反应的核转录因子,被激活后结合至DNA相应的位点,调节下游靶基因的转录表达,它可被多种物质激活,如TNF-α。故本实验采用RT-PCR法和酶谱分析法(zymography)观察不同浓度TNF-α对体外培养的人眼小梁细胞(human trabecular cells,HTCs)MMP-3和MMP-9表达的影响,并运用NF-κB的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶(pyrrolidine dithocarba-mate,PDTC)抑制NF-κB的活化,观察抑制后TNF-α对小梁细胞MMP-3和MMP-9表达影响的改变,并探讨这种改变的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  眼球  来源于意外死亡的健康成年人眼球组织,均经家属自愿签署知情同意书后取材,供体年龄在25~45岁之间,共7只,死亡后24 h内取材。

    1.1.2  主要试剂  DMEM/F12培养液,胰蛋白酶(Gibco公司),Hank’s液(Hyclone公司),胎牛血清(华美公司),重组人TNF-α、标准MMP-3、MMP-9(R&D公司),鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体(anti-FN),鼠抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体(anti-NSE)(北京中山生物技术有限公司),鼠抗人层黏连蛋白单克隆抗体(anti-LN), SP试剂盒,AEC Kit(福州迈新生物技术开发公司),Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司),氯仿,异丙醇,无水乙醇,DEPC处理水(上海化学试剂有限公司),逆转录试剂盒(Fermentas公司),PCR试剂盒(上海博亚生物技术有限公司),PCR Mark (CASARRAY),明胶、酪蛋白、PDTC(Sigma公司),40%丙烯酰胺、Tris、SDS、过硫酸铵、TritonX-100、甘氨酸、叠氮钠、CaCl2·2H2O、ZnCl2、溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250、甲醇、冰乙酸、甘油(上海生物技术开发公司)、TEMED(Amreso公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养及鉴定  人眼小梁细胞(human trabecular cells,HTCs)的体外培养采取组织块法[1-3]。应用解剖显微镜于无菌条件下,沿角膜緣后3~5 mm处环形剪开,去掉后节,前节倒置于无菌台上。在解剖显微镜下把自制的细铜丝插入Schlemm氏管,仔细分离小梁网,剪成2 mm×1 mm×1 mm大小的组织块,放入25 ml培养瓶底中,贴壁30 min后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,置于含5% CO2、100%湿度、37℃ 恒温培养箱中培养。当细胞融合后用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化传代培养。于光镜、倒置显微镜、透射电镜下观察,并进行纤维连结蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin,LN)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)免疫组化染色。另将消化后的细胞离心后弃上清,加入2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合液固定,送电镜室常规透射电镜标本制备,观察细胞超微结构并摄片。

    1.2.2  实验分组  取第3代HTCs以5×104/ml的浓度接种于6孔板中,待细胞融合后,无血清培养   48 h后,随机分为6组:1~4组施加TNF-α终浓度分别为0(对照组)、1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml的培养液(不含血清),第5,6孔以100 ?滋mol/L的(PDTC)预处理30 min后,分别于TNF-α终浓度为10 ng/ml、25 ng/ml的培养液(不含血清)中培养, 均培养24 min后进行下一步的RT-PCR。另收获细胞培养上清液,记录细胞数,于离心半径4.5 cm,2000 r/min离心10 min,提取上清液,于-70℃冰箱保存,进行酶谱实验。

    1.2.3  RNA提取  取上述培养的HTCs,按试剂盒说明书采取Trizol一步法提取总RNA,经含溴化乙啶的甲醛琼脂糖凝胶电泳,紫外光透射下可见清晰完整的18S和28S条带,经紫外线分光光度计检测纯度(OD260/OD280)在1.8以上,各组取总RNA 2 ?滋g,加OligodT18primer(0.5 ?滋g/?滋l) 1 ?滋l加DEPC-treated water至12 ?滋l,混匀轻离心后70℃水浴孵育5 min,立即置于冰上。加入5×reation Buffer 4 ?滋l,10 mM dNTP 2 ?滋l,RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 U/?滋l) 1?滋l,混匀轻离后37℃水浴孵育5 min。加入RevertAid TM M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/?滋l) 1?滋l,混匀轻离后42℃水浴孵育60 min。70℃水浴10 min终止反应,合成的cDNA置于-20℃保存备用。

    1.2.4  逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)  各取   2 ?滋l cDNA进行PCR扩增。MMP-3引物合成参照Li等[2]的报道,MMP-9和β-actin引物应用primer5.0软件自行设计,上述引物均由博亚生物制品有限公司合成。MMP-3引物的序列上游为5′-CCTGCTTTGTCCTTTGATGC-3′,下游为5′- TGAGTCAATCCCTGGAAAGTC-3′,片断长度432 bp;MMP-9引物的序列上游为5′-GGGACGGCAATGCTGAT-3′,下游为5′-CGCCACGAGGAACAAACT-3′,片断长度362 bp;选取β-actin作为内对照,β-actin引物的序列上游为5′-CTATTGGCAACGAGCGGTTC-3′,下游为5′-CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT-3′。PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,退火温度不同引物各有不同(MMP-3退火温度为55℃,MMP-9为60℃,β-actin为58℃)1 min,72℃延伸1 min,共35个循环,最后72℃延伸10 min。分别取5 ?滋l扩增产物(MMP-3,MMP-9)与β-actin扩增产物混合上样,加Maker 3?滋l,在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳, 经凝胶电泳图像分析仪拍照,并分析电泳条带的相对灰度值,计算出目的基因的mRNA水平的相对表达量。所有实验均重复3次,所得数据均采用均数±标准差表示。

    1.2.5  酶谱分析(zymography)法[3-4]  用分别含有酪蛋白和明胶的SDS-PAGE检测MMP-3和MMP-9的活性。分离胶浓度为8%(含0.2%酪蛋白或明胶),浓缩胶为5%,根据各处理组细胞数调节培养上清液的上样量。同时加入标准MMP-3和MMP-9作为标准对照。SDS-PAGE电泳结束后,凝胶连续振荡于2.5%Triton X-100溶液中以除去SDS。将凝胶置于反应液(50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl,1 ?滋mol/L ZnCl2,pH值为7.5)中37℃孵育24 h,0.1%考马斯亮蓝染色液染色2 h,脱色液脱色至蓝色背景下白色条带清晰。此凝胶经凝胶成像分析系统分析读取条带面积和灰度。条带酶解量=条带面积×(条带灰度-背景灰度),以反映酶的含量。

    1.2.6  统计学方法  以上实验重复3次。所有数据均以均数±标准差形式表示,采用SPSS for Windows11.0软件进行Levene方差齐性检验,单因素六水平设计定量资料的方差分析,LSD两两组间多重比较各组间差异的显著性。单因素六水平设计定量资料的方差分析,LSD两两组间多重比较各组间差异的显著性。

    2  结果

    2.1  NF-κB在TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9表达影响中的作用

    2.1.1  RT-PCR结果  Trizol一步法提取的总RNA经紫外线分光光度计检测纯度(OD260/OD280)在1.8以上。体外培养的HTCs总RNA经逆转录、扩增后得到目的基因MMP-3,MMP-9的片断分别约为432 bp(碱基),362 bp,扩增出的内参β-actin片断约为776 bp,与预期结果一致。?譹?訛体外培养的HTCs中MMP-3和MMP-9 mRNA有一定量的表达(见图1、图2)。?譺?訛实验数据见表1,表2。经Levene方差齐性检验,P>0.05,因此各组方差齐性,故采用单因素六水平方差分析,F值分别79.935和66.514,P<0.05,总的来说:四种不同浓度TNF-α调节HTMc表达MMP-3 mRNA/β-actin灰度比值和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值有差别(见表1,表2)。经LSD两两组间多重比较:对照组与实验组三种不同浓度TNF-α相比调节人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMc)表达MMP-3 mRNA/β-actin灰度和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值差异均有显著性(P<0.05)。提前30 min加入PDTC,MMP-3/β-actin灰度比值和MMP-9 mRNA/β-actin灰度比值均较未加入PDTC处理组明显减少(P<0.05)。

    2.1.2  酶谱分析(zymography)技术对MMP-3和MMP-9的定量分析  用含有酪蛋白或明胶的SDS-PAGE对MMP-3或MMP-9的活性检测结果表明,各组细胞培养液均可使酪蛋白底物和明胶水解(见图3、图4)。实验数据见表1和表2,经Levene方差齐性检验,P>0.05,因此各组方差齐性,故采用单因素六水平方差分析,F值分别169.203和40.193,P<0.05,总的来说:四种不同浓度TNF-α 调节 HTMc 表达MMP-3和MMP-9条带酶解量均有差别。经LSD两两组间多重比较:对照组与实验组TNF-α终浓度分别为1 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml相比调节 HTMc表达MMP-3和MMP-9条带酶解量(P<0.05)。提前30 min加入PDTC,MMP-3和MMP-9条带酶解量均较未加入PDTC处理组明显减少(P<0.05)。

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(来源:互联网)(责编:duzhanhui)

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