眼视光学杂志 1999年第2期第1卷 论著

作者：沈炳棣　陶志华　朱涛

单位：沈炳棣　陶志华　朱涛（温州医学院细胞研究室　325027）

关键词：表皮生长因子；转化生长因子－β1；纤维连接蛋白；成纤维细胞

　　摘　要　目的：研究细胞因子对角膜成纤维细胞的生长作用，为细胞因子治疗角膜疾病的机制研究提供实验依据。方法：用MTT法测定细胞因子EGF、TGF－β₁、FN等对角膜成纤维细胞生长的影响作用。结果：EGF对角膜成纤维细胞具有生长调节作用。在0.01～1.0μg／ml浓度下，具有明显促生长作用（与0浓度组比较P＜0.001），其最佳浓度为0.1μg／ml，但浓度在10.0μg／ml时却对其具有明显抑制作用（与0浓度组比较P＜0.005），TGF－β₁（0.01～10.0ng／ml）、FN（0.01～10.0mg／ml）对角膜成纤维细胞未见明显促生长或抑制作用（P＞0.05）。结论：EGF能调节角膜成纤维细胞生长，而TGF、FN对角膜成纤维细胞生长无影响。

Effects of cytokines on rabbit corneal fibroblast proliferation

Shen Bingdi，Tao Zhihua，Zhu Tao. Department of Cell Research，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027

　　Abstract　Objective：To investigate the effects of several cytokines on rabbit corneal epithelial cell proliferation in order to provide experimental evidence of treating corneal disease with cytokines.Methods：A well－cultured system of rabbit corneal fibroblast was established to determine the effects of some cytokines such as epidermal growth factor（EGF），transforming growth factor－β₁（TGF－β₁），fibronectin（FN）on the culturing rabbit corneal fibroblast proliferation by MTT assay.Results：①EGF induce proliferation of alone in comparison with control in 0.01～1.0mg／ml（P＜0.01），but in 10.0mg／ml of EGF did markedly effect of inhibition（P＜0.005）. ②β₁－TGF（0.01～10.0mg／ml），FN（0.01～10.0mg／ml）didn’t induced proliferation or inhibition of corneal fibroblast alone（P＞0.05）.Conclusion：the result suggested EGF could regulate growth of rabbit corneal fibroblast；But TGF－β₁、FN couldn’t.

　　Keywords　Epidermal growth factor（EGF）　Transforming growth factor－β₁（TGF－β₁）　Fibronectin（FN）　Fibroblast

　　笔者等在培养了传代角膜成纤维细胞基础上，用MTT还原法测定了表皮生长因子（Epidermal Growth factor，EGF）、转化生长因子－β₁（Transforming growth factor－β₁，TGF－β₁）、纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）对角膜成纤维细胞的生长作用，为细胞因子治疗角膜疾病的机制研究提供依据，现将实验结果报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　培养液：采用F和RPMI1640的混和液（1∶1），其中加有10%FCS，0.3mg／ml谷氨酰胺，0.1U／ml胰岛素，0.5mg／ml氢化可的松，20U／ml庆大霉素，pH调正至7.2～7.4。

　　1.1.2　EGF：购自美国Sigma公司的冻干粉（Lot73H8952），用D－Hanks液配制，原始浓度为20μg／ml。

　　1.1.3　TGF－β1μg（1ml），Cat.No.1412272BoehringerMamnHeim。

　　1.1.4　FN：4mg／ml，购自Corning公司。

　　1.1.5　MTT：每毫升D－Hanks中溶解2mgMTT（serva，上海实生细胞生物技术公司分装），用0.22μm滤膜过滤除去细菌及不溶物。分装，置－20℃避光保存。

　　1.1.6　培养板：购自美国Corning公司的96孔培养板。

　　1.2　方法

　　1.2.1　角膜成纤维细胞的培养：取成年、体重1.5～2.0kg的日本大耳白兔眼角膜，用硅胶刀刮除角膜上皮细胞层和内皮细胞层，用手术剪剪成小块于小平皿中，置37℃5%CO₂的培养箱中培养，24h可见少量成纤维细胞贴壁生长，约10天细胞布满整个平皿时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养，每5～6天传代一次，经用无水乙醇固定，用手术刀刮下，行常规电镜观察，证实为纯成纤维细胞后，用于实验。

　　1.2.2　细胞因子对角膜成纤维细胞生长作用：将细胞浓度为1×10⁵／ml的角膜成纤维细胞接种于96孔培养板，每孔加100μl，并将其分成三组。一组加入含不同浓度EGF的RPMI640培养液100μl，使EGF的终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1.0、10.0μg／ml；第二组加入含不同浓度的TGF－β₁的RPMI1640培养液100μl，使TGF终浓度为0、0.1、1.0、10.0ng／ml；第三组加入含不同浓度的FN的RPMI1640培养液100μl，使FN终浓度为0、0.1、1.0、10.0mg／ml；每个浓度重复4孔，置37℃5%CO₂的培养箱中培养72h；加入2%MTT溶液50μl／孔，继续培养4h，离心5min，500r／min，去上清液，用每孔DMSO200μl溶解甲月替，用∑960全自动酶标仪于550mm处测其OD值。

　　1.2.3　统计学处理：每实验组重复4孔，组间数据比较采用t检验。

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