1转基因治疗青光眼的靶组织

    青光眼基因疗法特有的靶组织结构或细胞类型包括小梁网(trabecular meshwork, TM)、睫状上皮(ciliary epithelium, CE)、睫状肌(ciliary muscle, CM)、视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)和Müller细胞(MCs)。小梁网位于前房角，是一种由不同内皮细胞和细胞基质以特定结构形成的海绵状组织；它负责维持房水流出的阻力和保持眼球的形状。睫状上皮包括两种紧密连接的覆盖在睫状突的细胞层，外层细胞面向后房，是非色素性上皮，主要分泌房水。房水产生后，进入前房，通过小梁细胞和内层Schlemm管壁离开眼球而进入静脉系统。睫状肌紧邻睫状上皮和小梁网。一旦睫状肌收缩，晶状体调节力增加，小梁网的构型发生变化，房水流出易度增加。RGCs，视网膜的最内层细胞，通过其轴突将光信号传导至大脑，其轴突组成了视神经。许多刺激伤害，通常是眼压升高引起RGCs损害和凋亡，最后导致视神经纤维丧失[3]。

    2青光眼基因治疗的有关载体

    能将遗传物质传送入视网膜或RGC的载体系统至少应具备以下四种生物学特性：(1) 能对准目标的特有细胞类型，其目标或者是受染细胞，或者是邻近细胞，例如，引入分泌性治疗药物的基因。(2) 基因传导应该有效，即现有的载体滴度和有限的剂量可以很安全地注射入各种视网膜间隙，传代基因能有效地复制，并进入足够多的靶细胞，允许治疗药物在视网膜特定部位进行表达。(3) 载体相关表达应该恒定并适当地持续较长时间。(4) 载体本身毒性应该很低，这包括药理学毒性、针对传导基因产物、输入载体或者源于输入载体的任何表达基因的局部和全身免疫反应。

    目前用于青光眼转基因治疗，并满足这些生物学特性的载体可分为病毒和非病毒两种方法：

    2.1病毒方法 病毒方法是利用载有目的基因的复制缺陷病毒感染靶细胞。

    2.1.1相关的DNA病毒载体 ⑴ 腺病毒(adenovirus，Ad) 载体：最初的腺病毒载体能够搭载大约8kb的传代DNA。几种早期的病毒基因的附加失活作用产生的复制缺陷病毒载体能够在传导的视网膜细胞中生长并形成很高的滴度。基因表达通常在接种后24h内出现，这使得在动物模型中进行研究变得非常方便。重组的腺病毒由于宿主对输入的病毒颗粒本身和因为感染而产生的大量病毒蛋白质的反应，故具有相对的免疫原性。然而，眼部的相对免疫特性使得暂时性的腺病毒相关的基因治疗仍然有效。由于重组的腺病毒DNA并不能稳定地整合入宿主染色体的DNA中，所以其在眼组织中传达的基因表达是暂时性的，一般保存1～3mo。如果其引起的免疫反应能进一步减轻的话，特殊的短期基因治疗干预，将是有利时机[4]。⑵ 腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV) 载体：通常这种病毒感染人类，并不引起已知的疾病。它是一种小的单链DNA病毒，它本身只产生非常小的蛋白质，因此具有相对的非免疫原性。如果没有与野生型辅助病毒(通常是人类腺病毒) 一同感染，野生型AAV能稳定地整合入人类19号染色体的特定位点，并建立隐匿性感染。相反，由于在重组的AAV(rAAV)中删除了这种特殊整合位点所必需的病毒rep蛋白质，目前的AAV载体并不具备这种特性。然而，体内实验显示，rAAV能在长达数周或数月内缓慢地整合入随机的染色体位点，这取决于靶细胞，也使得长期性的、或者是永久性的传导成为可能。与重组的腺病毒不一样，rAAV似乎能传导正常的RGC和光感受器细胞与视网膜色素上皮细胞。但是，当前的rAAV具有两大缺陷：① 它限定了搭载的DNA不能超过4.8kb。尽管AAV适合于目前的可用于视神经保护治疗的绝大部分基因，但是，只有有限的空间用于调节成分，这是为精确地协调和控制基因表达所必需的，才能起作用。②如果rAAV整合确实是随机的话，理论上就存在插入的基因突变。这使得临床前期研究比其他载体更加费时，而且不可能很快用于视网膜变性疾病的动物模型中。目前一种新的，更加有效的rAAV包装技术能很好地避免低病毒滴度和野生型腺病毒辅助剂的低水平污染引起的一些早期问题[5]。⑶单疱病毒(herpes simple virus, HSV)载体：HSV能有效地将有益基因转入青光眼相关的结构和细胞。在猴和啮齿类，通过前房注射，在TM和CE转染效率很高，而其他细胞如虹膜色素上皮细胞和角膜内皮细胞转染效率较低。只有在CMV启动子和HSV载体一起进行实验时，基因表达最多持续10d[6,7]。HSV在RGCs亦能产生有效的转染，但在灵长类，其传导位置只局限于传送部位[3]。

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