[摘要]目的 研究视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)中凋亡相关基因野生型p53(WTp53)、bax和bcl-2表达的变化，探讨其作用机制。方法将28只Wistar大鼠随机分为正常组、缺血组，其中缺血组又分为再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6个组。建立RIRI动物模型，用免疫组织化学链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测再灌注后不同时段视网膜组织中WTp53、bax和bcl-2基因表达的变化。结果 缺血组视网膜再灌注后WTp53、Bax蛋白表达增加，与正常组比较，再灌注6～72 h差异有显著意义( F=487.19、281.97，q=11.526～ 52.401 ，P lt;0.05)。缺血组视网膜再灌注后Bcl-2蛋白表达无明显变化，与正常组比较，差异无显著性( P gt;0.05)。结论 缺血再灌注损伤引起WTp53、bax基因在视网膜神经节细胞层、神经纤维层与内核层表达增高;WTp53和bax可能通过诱导或促进神经节细胞凋亡参与了视网膜缺血再灌注损伤的发生。

　　[关键词] 视网膜;再灌注损伤;基因，WTp53;基因，bax;基因，bcl-2;大鼠，Wistar

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of WTp53，bax and bcl-2 in retina ischemia/reperfusion injury and explore the mechanism. MethodsTwenty-eight rats were randomly divided into normal (4 rats) and ischemia group， and the latter was subdivided into 1，6，12，24，48，and 72h after reperfusion， respectively. The rat model of experimental retina ischemia/reperfusion injury was made by increasing the intraocular pressure. The expression of WTp53， bax and bcl-2 was determined by streptavidin-biotin complex (SABC) immunohistochemistry. Results In ischemia group， WTp53 expression and bax expression increased significantly ( F=487.19，281.97;q=11.526-52.401; P lt;0.05)，while the bcl-2 expression had little change. Conclu-sionWTp53 and bax expression increase in RIRI. WTp53 and bax may play a part in RIRI by promoting apoptosis.

　　[KEY WORDS]retina; reperfusion injury; genes，WTp53; genes， bax; genes， bcl-2; rats， Wistar

　　视网膜缺血再灌注损伤是眼科常见的病理过程，严重影响病人视功能。其发生机制十分复杂，已成为近年眼科的研究热点之一。目前研究发现，视网膜缺血再灌注损伤中存在着神经细胞凋亡现象，且凋亡是视网膜神经细胞丢失的重要因素之一[1]。本实验通过建立大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，研究凋亡相关基因野生型p53(WTp53)、bax和bcl-2的表达变化，探讨视网膜缺血再灌注损伤的发生机制。现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1动物及分组 健康无眼疾的Wistar大鼠(青岛市实验动物与动物实验中心提供)28只，体质量250～300 g，雌雄不拘，室温环境饲养。随机分为两组:正常组(4只)、缺血再灌注组(24只)，其中缺 血再灌注组又分为再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6个组，每组4只大鼠。

　　1.1.2主要试剂 兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗(美国Santa Cruz生物技术公司生产)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒(武汉Boster生物工程公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1动物模型的建立 采用前房穿刺加压法建立大鼠缺血再灌注损伤模型，方法见文献[2]。

　　1.2.2标本的取材、固定与切片 分别于再灌注后1、6、12、24、48、72 h处死动物，摘除眼球，制作石蜡切片，方法见文献[2]。

　　1.2.3免疫组织化学染色 将标本的石蜡切片脱蜡至水，用蒸馏水新鲜配制体积分数0.03过氧化氢室温放置10 min，以灭活内源性过氧化氢酶，复合消化液室温浸浴10 min修复抗原，正常山羊血清室温 10 min封 闭非特异性抗原，加一抗(兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗) 37 ℃孵育2 h， 加二抗(生物素化山羊抗兔IgG)37 ℃水浴20 min，SABC法染色，DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。

　　1.2.4结果观察及数据处理 每只眼球取两张切片进行分析，应用双目光学显微镜(400倍)分别观察WTp53、Bax、Bcl-2蛋白表达(阳性染色呈棕黄色)。应用图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析(每张切片取4个视野，以视神经为基准分别向两侧各取2个视野)，对视网膜组织中WTp53和Bax蛋白表达进行相对定量。

　　2 结果

　　2.1WTp53蛋白的表达变化 正常大鼠视网膜中几乎无WTp53蛋白表达。WTp53蛋白于再灌注6 h开始在视网膜神经节细胞层少量表达，位于细胞核内，以后表达量逐渐增加，24 h达到高峰，此时除在神经节细胞层有强表达外，内核层也有散在的表达;48 h仍持续强表达; 72 h明 显下降，但仍较正常组为高。再灌注6、12、24、48、72 h的WTp53蛋白阳性表达结果与正常组比较，差异有显著性。见表1。

　　2.2 Bax蛋白的表达变化 正常大鼠视网膜中几乎无Bax蛋白表达。Bax蛋白于再灌注6 h开始在视网膜神经节细胞层有表达，位于细胞浆中，以后表达量逐渐增加，24 h达到高峰，此时除在神经节细胞层有强表达外，内核层也有散在表达;48 h已有所下降，但仍表达较强;72 h明显下降。再灌注6、12、24、48、72 h的Bax蛋白阳性表达结果与正常组比较，差异有显著性。见表1。

　　2.3Bcl-2蛋白的表达变化 正常组视网膜Bcl-2蛋白低表达于神经节细胞层、神经纤维层及内核层。缺血再灌注后各时间段表达差异无显著性。再灌注6、12、24、48、78 h的Bcl-2蛋白阳性表达结果与正常组比较，差异无显著性( P gt;0.05)。见表1。

　　表1 视网膜缺血再灌注后不同时段WTp53、Bax、Bcl-2蛋白的表达变化(略)

　　与正常组比较， F=487.19，281.97，* q=11.526～52.401， P lt; 0.05

　　3 讨论

　　有研究显示，大鼠视网膜缺血再灌注损伤后发生视网膜神经细胞凋亡，且凋亡在再灌注后6 h升 高， 24 h 达到高峰，之后有所下降[1，2]。凋亡是基因 介导的具有新的蛋白质合成的程序性死亡，细胞凋亡是级联式基因表达的结果。基因调控也在视网膜缺血再灌注损伤细胞凋亡中发挥关键作用[3]。细胞 内部的基因直接控制着凋亡的发生与发展，细胞外部因素通过信号传导而影响这些基因的表达，间接地调控细胞凋亡。目前已发现多种基因编码的产物参加了凋亡的控制，WTp53、bax和bcl-2为其中的重要成员，其中WTp53、bax为促凋亡基因，而bcl-2属于抑凋亡基因。体外实验和动物实验证实，神经细胞发生凋亡时伴随着WTp53基因高水平的表达[4，5]。应用WTp53基因的抑制物可防止细胞凋亡[6]，提示WTp53基因在神经细胞凋亡过程中起重要作用。国汉邦等[7]构建了含有WTp53基因的重组腺病毒载体，用此病毒感染胚胎大鼠神经细胞，观察神经细胞凋亡的发生，结果显示，WTp53基因导入可诱导神经细胞凋亡。本文应用免疫组织化学法检测显示，视网膜缺血再灌注后WTp53蛋白表达增加，主要位于神经节细胞层与神经纤维层。其表达规律为:再灌注后6 h开始表达，24 h达高峰，72 h明显减少，与牛膺筠等[2]研究结果相符。提示WTp53的过表达可能参与了视网膜神经节细胞凋亡的发生。bax基因位于染色体19q13.3-13.4，含有6个外显子，许多学者提出bax与bcl-2关系密切，而且bax是受p53调控的下游基因，在众多凋亡相关基因中，bcl-2、bax和p53之间的关系及其对凋亡的调控机制倍受关注。CHEN等[8]报道，bcl-2 mRNA阳性神经细胞再灌注后可延长存活时间，Bcl-2蛋白阳性表达的细胞存活;Bcl-2/Bax蛋白的比例决定细胞凋亡的趋势，Bcl-2/Bax的比例升高可抑制细胞的凋亡，反之，则可促进细胞凋亡;而bax与p53 mRNA阳性细胞随再灌注时间延长多趋于死亡，P53蛋白阳性表达的细胞多死亡。本文实验结果显示，视网膜Bax蛋白在缺血再灌注后6 h即有表达， 24 h达 到高峰，48 h开始下降，但仍维持较高的水平，至72 h明显减少。

　　与文献[2]研究结果相似。而bcl-2属抑凋亡基因，本实验中经缺血再灌注处理后各时间段Bcl-2蛋白表达无变化，也证实了在视网膜缺 血再灌注损伤中凋亡调控系统向促进凋亡方向发展。综上所述，视网膜缺血再灌注损伤后促凋亡基因WTp53和bax表达增加，而抑凋亡基因bcl-2的表达无明显变化。推测WTp53和bax可能通过诱导或促进神经节细胞凋亡参与了视网膜缺血再灌注损伤的发生。

　　[参考文献]

　　[1] KANEDA K， KASHII S， KUROSAWA T， et al. Apoptotic DNA fragmentation and upregulation of Bax induced by transi-ent ischemia of the rat retina[J]. Brain Res， 1999，815:11-20.

　　[2] 牛 膺筠，张瑞，周占宇，等. 碱性成纤维细胞生长因子对鼠视网膜缺血再灌注损伤的治疗作用[J].中华眼科杂志，2002，38(9):530-534.

　　[3] 袁 春燕，赵颖. 碱性成纤维细胞生长因子与视网膜缺血再灌注损伤[J].青岛大学医学院学报，2003，39(2):216-217.

　　[4] WOOD K， YOULE R. The role of free radicals and P53 in neuron apoptosis in vivo [J]. Neurosci， 1995，15:5851-5857.

　　[5] LA FERIA F， HALL C， NGOL， et al. Extracellular deposi-tion of beta;-amyloid upon P53-dependent neuronal cell death in transgenic mice [J]. Clin Invest， 1996，98:1626-1632.

　　[6] 蒋 雷，夏永静，黎健. 野生型P53基因导入对培养的兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用[J].中华心血管病杂志，1997，25:301-304.

　　[7] 国 汉邦，黎健，董军，等. 野生型P53基因导入诱导神经细胞凋亡[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2002，9(1):92-95.

　　[8] CHEN J， GRAHAM S H， NAKAYAMA M， et al. Apopto-sis repressor gene bcl-2 and bcl-x lare express edintherat brain following globalis-chemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab， 1997，17(1):1-10.