视网膜神经节细胞(RGC)是视网膜的第三级神经元,在视觉通路中起着重要的传导作用。许多眼科疾病(如视神经病、青光眼等)可导致RGC损伤、变性和凋亡,最终引起视功能丧失,因此保持或促进RGC存活及轴突生长对视功能的维持至关重要，目前国内外学者都在努力探寻体外培养RGC的最有效方法。笔者就RGC的培养、分离、鉴定、纯化等方法的研究进展作一综述。
1 材料来源
由于成年RGC体外培养不易存活,目前多数学者采用胚胎期或生后<1周的大鼠进行RGC培养[13],来源方便且经济。Sernagor等发现,采用生后3～5 d大鼠的RGC培养成活率低,因此建议用胚胎期、生后早期或成年动物来进行RGC培养[4]。另外，有色素鼠在分离时因有色素背景而使视网膜容易辨认;相反，白化鼠则较难分辨且有视觉缺陷,因此有学者建议以有色素鼠作为RGC材料来源更佳[5]。最近有报道以大鼠RGC细胞株(RGC5)进行神经毒理学方面研究,但RTPCR分析表明,该细胞株源于整个视网膜而非单独的RGC,进一步研究发现此细胞株无法产生正常RGC的电压门控电流[68]。因此，RGC5作为RGC的代用品尚需进一步研究证实。
2 RGC备方法细胞悬液的制备方法
将视网膜结缔组织分散成细胞团或单个细胞,有以下方法:(1)机械分散法：剪刀剪切后用吸管反复吹打分散组织细胞,或将组织放在注射器内通过针头压出。具体操作如下：首先将组织用Hank’s液或无血清培养液漂洗,然后将其剪成5～10 mm×5～10 mm×5～10 mm小块,置入50目孔径不锈钢筛中，把筛网放在培养皿中，再用注射器针芯轻轻压挤组织,使之穿过纱网,然后用吸管从培养皿中吸出组织悬液,置入200目筛中重复上述操作。最后将上述细胞悬液置于显微镜下计算细胞数,再接种培养,如细胞团块过大,可用400目筛再过滤一次。该方法对组织损伤较大。Hayashida等在不用蛋白水解酶的条件下,先在低Ca2+溶液中孵育眼球壁，后用滤膜剥或刀片切,再置于低Ca2+溶液中孵育一次,最后经研磨,可将鱼和鼠的视网膜细胞离解[9]。(2)酶消化法：目前较常采用该法。它是将视网膜结缔组织完全消化成为细胞悬液。具体操作如下:组织剪碎后加008%胰蛋白酶消化15～20 min,然后加含小牛血清的DMEM培养液终止消化,后离心、弃上清,加完全培养液充分吹打成单细胞悬液即可[2]。Yasumasa等用15 U/mL木瓜蛋白酶和70 U/mL胶原酶37 ℃消化30 min,证实效果良好[10]。另外,玻璃体中的透明质酸可引起细胞的聚集,如在消化过程中加用02%透明质酸酶可分解残留在视网膜上的透明质酸,从而有效地防止细胞的聚集[3]。有一点需要说明,组织消化所需的时间和酶浓度应根据实验需要有所不同,但以保持细胞活性较高为前提。
3 培养板、培养皿的处理
RGC的培养需要对培养物品进行包被处理,以利于RGC的贴壁生长。常用的是层黏连蛋白(LN)、聚L赖氨酸、聚D赖氨酸、多聚鸟氨酸、小牛胶原、鼠尾胶原、板素、Cell Tak(一种生物聚合体)及纤维连接蛋白。近来还有学者用细胞黏附分子L1和N钙黏连素、抗Thy1单克隆抗体、玻璃黏连蛋白包被[11]。
31 LN和多聚氨基酸包被法 培养皿以1 μg/mL LN包被,37 ℃过夜;或用01 mg/mL的多聚氨基酸室温下包被过夜;或先用多聚氨基酸室温下包被2 h,再用LN包被,37 ℃过夜。
32 鼠尾胶原包被法 将SD大鼠尾巴切成2～3 cm小段,75%乙醇浸泡>24 h,后抽出尾腱剪碎，浸入01%醋酸溶液中，于4 ℃冰箱浸泡48～72 h,4 000 r/min离心30 min,取上清,8磅灭菌消毒后分装,置于4 ℃冰箱保存备用或-20 ℃长期保存(一般配成1～3 mg/mL)。使用时用高纯度的蒸馏水稀释成01 mg/mL的质量浓度,再以50 μL/cm2的量均匀涂于培养底物的表面(注意要使表面全部被溶液覆盖)，室温下静置20～30 min。最后吸除多余溶液,以少量灭菌蒸馏水洗涤,将水分吸净控干即可。赵丽萍等比较了各种支持物对培养鸡胚前脑神经元的不同促进效应,得出以下结论:人羊膜上皮面>鼠尾胶原>多聚鸟氨酸>板素>纤维连接蛋白>人羊膜基底面>I型胶原。但羊膜透明度差,显微镜下难以辨认培养细胞的轮廓,而鼠尾胶原透明,使用方便,且易于获得[12]。因此用鼠尾胶原作为支持物不但加速了细胞的贴壁,而且在改善培养细胞的微环境方面亦起了重要作用。
33 抗Thy1单克隆抗体包被法 用抗Thy1单克隆抗体包被培养板可促进RGC轴突的再生[13]。常用抗Thy1单克隆抗体包括OX7和2G12两种克隆型,抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至体积比为1∶40。包被方法同31。
4 培养基
41 含血清培养基 血清具有促进体外培养细胞贴壁生长作用。视网膜神经元的培养,在有1%～10%血清存在时生长、分化较好,血清的存在可增强RGC存活率。目前常使用10%胎牛血清或小牛血清。
42 无血清的合成培养基 无血清培养基种类繁多,根据不同细胞各组分及浓度稍有不同。Bates等研究证实,在体外培养时,含血清的培养基会抑制胚胎鼠RGC轴突在板素上的生长,而无血清培养时,胚胎鼠轴突生长快速,提示血清中有某些成分抑制胚胎鼠轴突在板素上的生长,但研究表明有无血清对培养成年鼠的轴突生长影响无明显差别[14]。除此之外，有些学者认为无血清培养液中的各种成分对RGC的影响较易控制,便于研究底物、细胞及神经营养因子对RGC作用,得出较可靠的结论。福建医科大学学报 2006年3月 第40卷第2期蓝丹锋等：视网膜神经节细胞体外培养研究进展
5 培养方法
51 乳鼠RGC的混合培养 取乳鼠眼球,于解剖显微镜下钝性分离视网膜,剪碎后加008%胰蛋白酶消化15～20 min或0125%胰蛋白酶消化20 min,后加含小牛血清的DMEM终止消化。然后离心去上清,加完全培养液充分吹打成单细胞悬液,计数,调整培养液使细胞数为1×105 mL1。接种于包被有鼠尾胶原的培养板上,最后置于37 ℃、体积分数为005的CO2培养箱内培养[2]。此方法培养的RGC存活>2周,存活时间较长,但培养的细胞中杂有其他神经细胞和非神经细胞,对RGC的干预性研究影响较大。
52 乳鼠RGC的纯化培养 分别用抗鼠巨噬细胞单抗——MAC1 (1∶10 PBS液稀释)和抗鼠Thy1单抗——2G12 (1∶100 PBS液稀释)孵育聚丙烯试管,4 ℃过夜，后用PBS反复冲洗试管,以防非特异性细胞粘附到试管上。视网膜细胞悬液在MAC1抗体包被的试管中孵育，室温30 min,每隔10 min轻摇悬液,以确保全部细胞接触包被区域表面;去除非粘附细胞,放入2G12抗体包被的试管中,如上孵育30 min后,PBS反复冲洗试管;最后用0125%胰蛋白酶将粘附于2G12抗体的细胞洗脱下来,600 r/min离心5 min后移入培养液,接种到包被好的培养皿中,最后置于37 ℃、体积分数为005的CO2培养箱内培养[1516]。此种培养方法的优点是排除了其他细胞的干扰,利于干预性研究,但缺点是只能使RGC存活48 h,不利于对其进行体外研究。
53 三维原代培养 取10周龄Wistar系大鼠视网膜组织(距视盘10～15 mm),将其切成边长500 μm的方形片。于0 ℃环境下,将配置好的胶原溶液滴于用10 mg/L多聚赖氨酸包被的培养孔中央,形成直径15 mm的胶原溶液层(胶原溶液成分:(1)用CH3COOH溶液稀释的03%Ⅰ型胶原(从大鼠尾巴提取) pH 30;(2)10倍浓度的MEM(minimum essential medium)培养液;(3)每100 mL含NaHCO3 220 g和Hepes 477 g的005 mol/L NaOH。三部分比例为8∶1∶1)。再将视网膜片的神经纤维层向下浸入胶原溶液层中,于37 ℃水浴5 min。随着液态胶原凝固成盘状凝胶,视网膜片亦固定其中。随后于培养孔中加入培养液,置于37 ℃、体积分数为005的CO2恒温箱中培养[17]。此培养方法使神经突起生长成活率较高,存活时间较长,即使于无血清培养液中也可存活>2周,而无需加入昂贵的神经生长因子。同时把RGC和固有的神经支持细胞一起培养,比较接近体内环境,培养出的神经突更接近于生理状态。目前就RGC培养的材料选择而言,许多学者偏向于低龄大鼠,但缺点是培养出的RGC细胞形态幼稚。而人类多种疾病主要表现在成熟个体,三维原代培养采用10 周龄大鼠,较能反映成熟RGC的生理和病理功能,得出的结论更具有说服力。
54 共培养方法 即RGC与一系列神经胶质细胞或组织一起培养,如星形胶质细胞、Müller细胞、雪旺细胞、嗅被盖细胞、晶体组织和人羊膜上皮细胞[1823]。此方法能促进RGC的存活和生长。
55 引产胎儿混合RGC的培养方法 取孕7月引产胎儿,死后约4 h摘除眼球[24]。培养方法同乳鼠RGC混合培养方法。此方法培养出的RGC无种属差异,但材料来源有限。
56 成人RGC体外培养 捐献的成人眼球用酶消化法，并在培养液中加入成纤维生长因子,可成功培养出成人RGC,为人类疾病的研究提供更好的模型,但来源仍然有限[25]。
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