1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1动物及分组 健康无眼疾的Wistar大鼠(青岛市实验动物与动物实验中心提供)28只，体质量250～300 g，雌雄不拘，室温环境饲养。随机分为两组:正常组(4只)、缺血再灌注组(24只)，其中缺 血再灌注组又分为再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6个组，每组4只大鼠。

　　1.1.2主要试剂 兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗(美国Santa Cruz生物技术公司生产)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒(武汉Boster生物工程公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1动物模型的建立 采用前房穿刺加压法建立大鼠缺血再灌注损伤模型，方法见文献[2]。

　　1.2.2标本的取材、固定与切片 分别于再灌注后1、6、12、24、48、72 h处死动物，摘除眼球，制作石蜡切片，方法见文献[2]。

　　1.2.3免疫组织化学染色 将标本的石蜡切片脱蜡至水，用蒸馏水新鲜配制体积分数0.03过氧化氢室温放置10 min，以灭活内源性过氧化氢酶，复合消化液室温浸浴10 min修复抗原，正常山羊血清室温 10 min封 闭非特异性抗原，加一抗(兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗) 37 ℃孵育2 h， 加二抗(生物素化山羊抗兔IgG)37 ℃水浴20 min，SABC法染色，DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。

　　1.2.4结果观察及数据处理 每只眼球取两张切片进行分析，应用双目光学显微镜(400倍)分别观察WTp53、Bax、Bcl-2蛋白表达(阳性染色呈棕黄色)。应用图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析(每张切片取4个视野，以视神经为基准分别向两侧各取2个视野)，对视网膜组织中WTp53和Bax蛋白表达进行相对定量。

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