【摘要】 目的：探讨骨桥蛋白(osteopontin,OPN)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy PDR)中的作用,并初步分析OPN及VEGF与PDR间的相关关系,为研究PDR的发病机制、预防及治疗提供实验依据和理论基础。方法：取2008年3月至2008年12月间PDR 28例(PDR组)和特发性黄斑裂孔(IMH)24例(IMH组)患者的玻璃体液样本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定玻璃体液中OPN及VEGF浓度，应用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析。结果：PDR组玻璃体液中OPN浓度为(883.39±151.12) ng·ml-1,VEGF浓度为(1 158.68±140.98) pg·ml-1;IMH组OPN浓度为(537.88±166.37) ng·ml-1,VEGF浓度为(295.91±109.62) pg·ml-1。PDR组较IMH组不仅OPN表达增高(P<0.01),VEGF也表达增高(P<0.01);PDR组玻璃体液中OPN浓度与VEGF浓度呈正相关(r=0.69,P<0.01)。结论：PDR患者玻璃体液中OPN与VEGF含量高于非糖尿病患者,OPN与VEGF在PDR病理性新生血管的发生、发展中可能起到促增生作用。
【关键词】 骨桥蛋白; 血管内皮生长因子; 增生性糖尿病视网膜病变; 玻璃体液
Expression of osteopontin and vascular endothdial growth factor of vitreous in patients with proliferative diabetic retinopathy
MA Yanping,ZHU Chenghua
(Department of Ophthalmology,Shanghai Meishan Hospital,Nanjing 210039,China;Department of Ophthalmology,the First Affliliated Hospital to Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)
[Abstract] Objective:To investigate the levels of osteopontin (OPN) and vascular endothelial growth factor (VEGF) of vitreous in patients with proliferative diabetic retinopathy(PDR),and to explore the association between OPN,VEGF and the development of PDR. Methods: The levels of OPN and VEGF in the vitreous of 28 eyes of 28 patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR group) and 24 eyes of 24 patients with idiopathic macular hole (IMH group) were measured by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Vitreous fluid samples were obtained by vitrectomy.Results:The vitreous level of OPN was significantly higher in PDR group [(883.39±151.12) ng·ml-1] than in IMH group [(537.88±166.37) ng·ml-1,P<0.01].The vitreous concentration of VEGF was also significantly higher in PDR group[(1 158.68±140.98) pg·ml-1] than in IMH group [(295.91±109.62 pg·ml-1),P<0.01].The vitreous concentration of OPN correlated significantly with that of VEGF in PDR group [(correlation coefficient) r=0.69,P<0.01]Conclusions:Vitreous levels of both OPN and VEGF in patients with PDR are significantly higher than those of nondiabetic patients.OPN is probably correlated with VEGF in angiogenesis in PDR.
[Key words] osteopontin; vascular endothelial growth factor; proliferative diabetic retinopathy; vitreous
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见和最为严重的微血管并发症,特别是增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)可引起糖尿病患者严重的视力丧失。据统计,2型糖尿病患者致盲原因中DR的致盲率为33%,1型糖尿病患者则高达86%[1]。玻璃体液是高惰性的，并且受血—视网膜屏障保护，能间接反映视网膜分泌的细胞因子水平。玻璃体切割手术时获得的玻璃体液使对人眼中细胞分子水平的研究成为可能。骨桥蛋白(steopontin,OPN)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前增生性视网膜疾病研究的热点，本实验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定OPN和VEGF含量,通过对PDR与非DR患者玻璃体液中OPN与VEGF含量的比较及分析,初步了解OPN和VEGF之间的关系,以及两者与PDR发生、发展之间的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
收集南京医科大学第一附属医院眼科2008年3月至2008年12月28例(11男,17女)PDR患者(PDR组)的玻璃体液,年龄30～75岁;选取特发性黄斑裂孔(IMH)患者玻璃体液样本24例(7男,17女)作对照组(IMH组),年龄52～77岁。两组间年龄、性别差异均无统计意义。诊断标准参照DR国际分类法(1983年),直接、间接眼底镜检查及眼B超和眼底荧光造影(FFA)检查结果。两组均行现代闭合式玻璃体切割手术,排除眼外伤、高度近视以及眼底静脉阻塞等引起的玻璃体视网膜病变等病例。
1.2 标本采集
玻璃体液取样：开睑后以0.5 g·L-1碘伏稀释液消毒结膜囊,无菌生理盐水反复冲洗,无菌纱布吸尽结膜囊中残液,在玻璃体腔灌注前由睫状体平坦部抽取玻璃体液样本,约0.2 ml,标本移至已消毒并硅化的0.5 ml Eppendorf管,存放于-70 ℃冰箱备用。
1.3 实验材料
人OPN试剂盒(human osteopontin immunoassay,catalog number DOST00，美国R&D公司产品),550型酶标仪(美国),Taq酶(5 U·μl-1，美国Invitrogen公司),IQ5荧光定量仪(BIOrad公司)。
1.3.1 玻璃体液OPN与VEGF浓度测定
从冰箱中取出标本,置于室温下10 min待测。根据ELISA试剂盒的说明,将标准品用稀释液定比稀释,充分混匀。将酶标板各孔依次编号,每孔加RD16 100 μl,并加入50 μl 标准液或样品,混匀封口。室温下孵化2 h,弃液,冲洗液清洗4次。每孔加入200 μl OPN Conjugate,封口室温下孵化2 h。弃液,冲洗液清洗4次。避光情况下每孔加入200 μl底物显色溶液,混匀,孵化30 min。再每孔加50 μl反应终止液,混匀。酶标仪550 nm处读数,30 min内测定各孔吸光度值(A值)。VEGF测定方法类似。根据定比稀释标准品的A值绘制标准曲线,以样品的A值和标准曲线算出样品中OPN与VEGF的含量。
1.4 统计学处理
实验数据均以x-±s表示,使用SPSS 11.5软件包进行两样本均数的t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
见表1。表1 PDR与IMH组玻璃体液中OPN与VEGF水平(略)
由表1可见PDR组OPN及VEGF表达均较IMH组增高(P<0.01)。经分析PDR组OPN与VEGF相关性回归方程为Y=549+0.690X,见图1。
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